蜜蜂球囊菌菌絲和孢子中全長轉(zhuǎn)錄本的差異表達分析

杜 宇, 蔣海賓, 王 杰, 范小雪, 王秀娜, 馮睿蓉, 張文德,隆 琦, 熊翠玲, 鄭燕珍,2, 陳大福,2, 郭 睿,2,*

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院), 福州 350002; 2. 福建農(nóng)林大學(xué), 蜂產(chǎn)品加工與應(yīng)用教育部工程研究中心, 福州 350002;3. 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 福州 350002; 4. 福建農(nóng)林大學(xué), 福建省病原真菌與真菌毒素重點實驗室, 福州 350002)

蜜蜂球囊菌Ascosphaeraapis(簡稱“球囊菌”)是一種致死性真菌病原，專性侵染蜜蜂幼蟲而導(dǎo)致白堊病。該病于1992年在我國全面暴發(fā)，并往往發(fā)生在涼爽濕潤的季節(jié)，與蜂群大量繁殖的春季和秋季相吻合，可導(dǎo)致成年蜜蜂數(shù)量和蜂群群勢的急劇下降，嚴(yán)重影響蜂產(chǎn)品的可持續(xù)發(fā)展(Aronstein and Murray, 2010; 趙紅霞等, 2014)。低日齡蜜蜂幼蟲易受球囊菌感染，而成年蜜蜂可作為媒介在蜂群內(nèi)傳播疾病。球囊菌孢子隨食物進入蜜蜂幼蟲中腸，因此時中腸與后腸隔絕，腸道內(nèi)低氧環(huán)境使孢子處于低水平萌發(fā)狀態(tài)，直至幼蟲到預(yù)蛹的過渡期，中腸與后腸連通，球囊菌進入后腸接觸氧氣后劇烈萌發(fā)，菌絲開始大量生長，相繼穿透腸壁和體壁，最終蔓延包裹幼蟲全身，形成白色或棕黑色的堅硬蟲尸(Jensenetal., 2013)。諸多生態(tài)因子如溫度、濕度、酸堿度(pH)、二氧化碳(CO2)濃度、輻射及營養(yǎng)素條件等均對球囊菌的生長和白堊病暴發(fā)產(chǎn)生一定影響，外部溫度介于(31～35)±0.5℃，相對濕度在80%以上，pH值介于5～7.8，且CO2濃度高于10%的環(huán)境條件有利于球囊菌孢子的萌發(fā)(梁勤等, 2000, 2001; Vojvodicetal., 2011; Jensenetal., 2013; 董文濱, 2014)。球囊菌侵染可引起宿主的脅迫應(yīng)答。Aronstein等(2010)利用cDNA-AFLP和qRT-PCR技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)1日齡西方蜜蜂Apismellifera每頭幼蟲攝入1×105個球囊菌孢子后，其攝食率迅速下降，并影響宿主體內(nèi)免疫信號途徑的激活以及抗菌肽相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄過程。王立立(2014)研究發(fā)現(xiàn)意大利蜜蜂Apismelliferaligustica5日齡幼蟲被5×107孢子/mL濃度的球囊菌侵染后，血淋巴內(nèi)酚氧化酶原級聯(lián)反應(yīng)為主的體液免疫被顯著激活，并催化黑化反應(yīng)。

此前，由于基因組基因功能注釋信息的缺失，球囊菌的分子生物學(xué)研究進展緩慢。Shang等(2016)通過二代測序技術(shù)對球囊菌ARSEF 7405菌株進行了基因組測序、組裝和注釋，公布了scafford水平的球囊菌參考基因組(assembly AAP 1.0)，為其分子生物學(xué)及組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。近年來，以RNA-seq為代表的第二代高通量測序技術(shù)發(fā)展迅猛，為探究蜜蜂與球囊菌的互作機制提供了強大技術(shù)手段。前人利用二代測序技術(shù)對球囊菌進行的轉(zhuǎn)錄組研究僅有一例報道，Cornman等(2012)對來自培養(yǎng)基的球囊菌菌絲和來自西方蜜蜂幼蟲感染組織的球囊菌菌絲進行了轉(zhuǎn)錄組測序，功能分析表明球囊菌的差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)參與了交配類型、細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和應(yīng)激反應(yīng)。近年來，筆者所在團隊基于二代測序技術(shù)對球囊菌進行了一系列轉(zhuǎn)錄組研究，例如基于Illumina測序數(shù)據(jù)組裝和注釋了球囊菌的首個參考轉(zhuǎn)錄組，并大規(guī)模開發(fā)了球囊菌的SSR(張曌楠等, 2017)；利用二代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對球囊菌的參考基因組注釋進行了補充和完善(郭睿等, 2019)；通過比較轉(zhuǎn)錄組分析初步揭示了球囊菌對意蜂幼蟲和中蜂幼蟲的侵染機制(陳大福等, 2017; 郭睿等, 2017)；并在全基因組水平鑒定和分析了球囊菌的微小RNA(microRNA, miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)和環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)(Chenetal., 2018; Guoetal., 2018; 郭睿等, 2018)。二代測序技術(shù)雖具有通量和準(zhǔn)確性較高的優(yōu)勢，但同時也存在測序讀段較短(不超過300 bp)的劣勢，需要通過生物信息學(xué)算法對測序得到的短讀段進行拼接和組裝，以得到較長的轉(zhuǎn)錄本(Boldogk?ietal., 2019)。因此，基于二代短讀段數(shù)據(jù)只能進行基因的定量和差異表達分析，無法開展轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)、定量和差異表達分析(Tombáczetal., 2018)。此外，基于二代測序數(shù)據(jù)的基因定量實際上是對來源于同一個基因的不同剪接異構(gòu)體的表達量取平均值，因而混淆了不同剪接異構(gòu)體的真實表達量。因此，在轉(zhuǎn)錄本水平進行定量和差異表達分析對于深入理解物種的轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性及動態(tài)變化尤為必要。

近年來，以牛津納米孔(Oxford Nanopore)長讀段測序技術(shù)為代表的三代測序技術(shù)逐漸興起和成熟，因具有超長讀段(平均約15 kb)、較高準(zhǔn)確性和直接讀取核酸修飾等優(yōu)勢而成功應(yīng)用于人、兔和橄欖實蠅Dacusoleae等物種的全長轉(zhuǎn)錄組研究(Chenetal., 2017; Bayegaetal., 2018; Workmanetal., 2019)。此外，由于三代測序得到的超長讀段無需拼接便能獲取轉(zhuǎn)錄本序列全長，使轉(zhuǎn)錄本的精確定量和差異表達分析成為現(xiàn)實(Weiratheretal., 2017)。目前，真菌的全長轉(zhuǎn)錄組研究十分有限(Piroonetal., 2018)；對于蜜蜂病原，迄今僅在東方蜜蜂微孢子蟲Nosemaceranae中有過相關(guān)研究報道(陳華枝等, 2020a, 2021a)。近期，筆者利用Nanopore長讀段測序技術(shù)對球囊菌的純化菌絲(Aam)和純化孢子(Aas)分別進行了轉(zhuǎn)錄組測序，基于混合數(shù)據(jù)構(gòu)建和注釋了球囊菌的高質(zhì)量全長轉(zhuǎn)錄組(杜宇等, 2021b)；系統(tǒng)鑒定和分析了Aam和Aas中基因的可變剪接(alternative splicing, AS)和可變腺苷酸化(alternative polyadenylation, APA)(杜宇等, 2021a)。然而到目前為止，球囊菌全長轉(zhuǎn)錄本定量及差異表達轉(zhuǎn)錄本(differentially expressed transcripts, DETs)分析未見報道。

本研究在前期研究基礎(chǔ)上對Aam和Aas中全長轉(zhuǎn)錄本進行定量分析，通過比較分析篩選出DETs并進行功能和通路注釋，進一步對Aam和Aas中DET的結(jié)構(gòu)進行比較，并構(gòu)建和分析DETs對應(yīng)蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)。研究結(jié)果可為闡明DETs在球囊菌的孢子萌發(fā)、菌絲生長和有性生殖等方面的分子功能提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 納米孔長讀段測序數(shù)據(jù)來源

前期已利用Oxford Nanopore技術(shù)對球囊菌Aam和Aas進行轉(zhuǎn)錄組測序，分別測得6 321 704和6 259 727條原始讀段，經(jīng)過濾分別得到5 669 436和6 233 159條有效讀段，并分別鑒定9 859和16 795條非冗余全長轉(zhuǎn)錄本(杜宇等, 2021b)。

1.2 全長轉(zhuǎn)錄本的表達量計算

利用minimap2軟件(Li, 2018)將1.1節(jié)Aam和Aas有效轉(zhuǎn)錄本讀段與球囊菌參考基因組(assembly AAP 1.0)注釋的已知轉(zhuǎn)錄本進行序列比對，獲取全長轉(zhuǎn)錄本與已知轉(zhuǎn)錄本的對應(yīng)信息。Nanopore全長轉(zhuǎn)錄組測序可以模擬成一個隨機抽樣的過程，為了讓片段數(shù)目能真實地反映轉(zhuǎn)錄本表達水平，首先對各樣品中的比對上球囊菌參考基因組的有效讀段數(shù)目進行歸一化處理，然后采用CPM(counts per million mapped reads)算法(Zhouetal., 2014)計算每一條全長轉(zhuǎn)錄本的表達量，公式如下：

CPM=比對到轉(zhuǎn)錄本上的讀段數(shù)(reads mapped to transcript)/樣本中對齊的總讀段數(shù)(total reads aligned in sample)×1 000 000。

1.3 DETs的篩選

將同一全長轉(zhuǎn)錄本在Aam和Aas中表達量的比值定義為相對變化倍數(shù)(fold change)。通過對差異顯著性P值進行校正得到錯誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)。由于Nanopore全長轉(zhuǎn)錄組測序的差異表達分析是對大量的全長轉(zhuǎn)錄本表達量進行獨立的統(tǒng)計假設(shè)檢驗，會存在假陽性問題，因此在進行差異表達分析過程中，采用了公認(rèn)的Benjamini-Hochberg校正方法對原有假設(shè)檢驗得到的顯著性P值進行校正，并最終采用FDR作為DETs篩選的關(guān)鍵指標(biāo)。 根據(jù)fold change≥2且FDR<0.01的標(biāo)準(zhǔn)，采用EBSeq軟件(Lengetal., 2013)從AasvsAam比較組中篩選DETs。

1.4 DETs的生物信息學(xué)分析

利用百邁克云平臺(https:∥international.biocloud.net)的相關(guān)工具繪制DETs的曼哈頓圖及表達量聚類熱圖。 利用BLAST工具將DETs比對GO數(shù)據(jù)庫(https:∥www.geneontology.org)和KEGG數(shù)據(jù)庫(https:∥www.genome.jp/kegg/)，獲得相應(yīng)的功能和通路注釋。再根據(jù)DETs與KEGG通路的注釋關(guān)系構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape軟件(Smootetal., 2011)進行網(wǎng)絡(luò)可視化。參照Sylvain等(2007)的方法，通過IGV(Integrative Genomics Viewer)瀏覽器對DETs的結(jié)構(gòu)進行可視化。

2 結(jié)果

2.1 球囊菌菌絲和孢子中全長轉(zhuǎn)錄本的表達量分析

Aam和Aas共有的表達轉(zhuǎn)錄本數(shù)量為19 966條，特有的表達轉(zhuǎn)錄本數(shù)量分別為1 273和2 856條。Aam中全長轉(zhuǎn)錄本的表達量介于0.0010～76 721.3655，其中表達量最高的為ONT.6598.1, ONT.4715.1和ONT.3612.1等(表1)。Aas中全長轉(zhuǎn)錄本的表達量介于0.0010～20 116.2770，其中表達量最高的為ONT.7346.1, ONT.2508.21和ONT.2150.1(表2)。此外，部分全長轉(zhuǎn)錄本同時在Aam和Aas中高量表達，例如ONT.705.2(CPM值分別為2 290.0785和9 827.5333), ONT.2558.1(CPM值分別為2 917.3948和6 693.9654)和ONT.4966.2(CPM值分別為6 640.7930和5 544.5046)。

表1 蜜蜂球囊菌菌絲(Aam)中CPM值前10位的全長轉(zhuǎn)錄本信息概要Table 1 Summary of full-length transcripts in Ascosphaeraapis mycelium (Aam) with the top 10 CPM values

2.2 球囊菌菌絲和孢子中DETs的篩選及表達量聚類

在AasvsAam比較組中共篩選到3 230條DETs，包含3 072條上調(diào)轉(zhuǎn)錄本和158條下調(diào)轉(zhuǎn)錄本。 上述DETs的log2(fold change)介于-6.5506～14.4956。上調(diào)倍數(shù)最大的全長轉(zhuǎn)錄本是ONT.4715.1，其次為ONT.7176.3和ONT.3781.2(表3)；下調(diào)倍數(shù)最大的全長轉(zhuǎn)錄本是rna5277，其次為ONT. 2275.2和ONT.7416.7(表4)。

表3 蜜蜂球囊菌Aas vs Aam比較組中前10位上調(diào)轉(zhuǎn)錄本的信息概要Table 3 Summary of the top 10 up-regulated transcripts in the Aas vs Aam comparison group of Ascosphaera apis

表4 蜜蜂球囊菌Aas vs Aam比較組中前10位下調(diào)轉(zhuǎn)錄本的信息概要Table 4 Summary of the top 10 down-regulated transcripts in the Aas vs Aam comparison group of Ascosphaera apis

2.3 球囊菌菌絲和孢子中DETs的功能和通路注釋

GO數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，上述DETs涉及生物學(xué)進程(biological process)、細(xì)胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function) 3個大類，其中有1 251條DETs注釋到生物學(xué)進程大類的16個功能條目，包括細(xì)胞進程(cellular process)、代謝進程(metabolic process)及單組織進程(single-organism process)等(圖1)；有1 170條DETs注釋到細(xì)胞組分大類的14個功能條目，包括細(xì)胞(cell)、細(xì)胞部分(cell part)及細(xì)胞器(organelle)等(圖1)；有1 157條DETs注釋到分子功能大類的12個功能條目，包括催化活性(catalytic activity)、結(jié)合(binding)和結(jié)構(gòu)分子活性(structural molecule activity)等(圖1)。

KEGG數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果顯示分別有36, 639和832條DETs注釋到細(xì)胞進程(celluar process)、遺傳信息處理(genetic information processing)和新陳代謝(metabolism)相關(guān)通路(圖2)。注釋DETs數(shù)量最多前5位通路分別為核糖體(ribosome)、抗生素的生物合成(biosynthesis of antibiotics)、碳代謝(carbon metabolism)、氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)及糖酵解/糖異生(glycolysis/gluconeogenesis)(圖2)。

進一步分析發(fā)現(xiàn)64條DETs注釋到糖酵解/糖異生，包括ONT.1193.1, ONT.1218.4和ONT.29.1等62條上調(diào)轉(zhuǎn)錄本，以及2條下調(diào)轉(zhuǎn)錄本(ONT.7961.1和ONT.7961.5)；ONT.5566.7, ONT.5566.3和ONT.4500.10等26條上調(diào)轉(zhuǎn)錄本注釋到內(nèi)吞作用。5條上調(diào)轉(zhuǎn)錄本(ONT.1358.7, ONT.1474.3, ONT.750.14, ONT.750.2和rna3824)以及2條下調(diào)轉(zhuǎn)錄本(ONT.5822.1和rna735)注釋到MAPK信號通路；2條上調(diào)轉(zhuǎn)錄本(ONT.750.14和ONT.750.2)同時注釋到內(nèi)吞作用和MAPK信號通路(圖3)。

圖3 蜜蜂球囊菌Aas vs Aam比較組中差異表達轉(zhuǎn)錄本(DETs)與糖酵解/糖異生、內(nèi)吞作用及MAPK信號通路的注釋關(guān)系網(wǎng)絡(luò)Fig. 3 Annotation relationship networks of glycolysis/gluconeogenesis, endocytosis and MAPK signaling pathway associateddifferentially expressed transcripts (DETs) in the Aas vs Aam comparison group of Ascosphaera apis

2.4 球囊菌菌絲和孢子中DETs的結(jié)構(gòu)比較

對Aam和Aas中DETs的結(jié)構(gòu)進行比較，發(fā)現(xiàn)685個DETs(ONT.3612.1, ONT.1081.2, ONT.1218.6和ONT.1534.4等)在菌絲和孢子中除具有不同的表達量外，同時也具有不同的結(jié)構(gòu)，例如全長轉(zhuǎn)錄本ONT.3612.1由分別在Aam和Aas中發(fā)現(xiàn)的剪接異構(gòu)體ONT.2373.1和ONT.3407.1合并得到，ONT.3612.1在Aam和Aas中的CPM值分別為33 850.23和47.22；此外，ONT.2373.1和ONT.3407.1的結(jié)構(gòu)存在差異，二者均含有1個外顯子，但前者的外顯子明顯短于后者(圖4)。

圖4 球囊菌菌絲(Aam)和孢子(Aas)中差異表達轉(zhuǎn)錄本 ONT.3612.1結(jié)構(gòu)的IGV瀏覽器視圖Fig. 4 IGV browser view of the structure of differentially expressed transcript ONT.3612.1in Ascosphaera apis mecylium (Aam) and spore (Aas)白色矩形表示scafford，上面的數(shù)字表示scafford上的堿基位置；紅色矩形、藍色矩形和綠色矩形表示外顯子，箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向；Final代表在Aam和Aas中鑒定到的轉(zhuǎn)錄本的合并結(jié)果。White rectangle indicates scafford, and the numbers above scafford indicate base position. Red rectangle, blue rectangle and green rectangle indicate exons, and arrows indicate the direction of transcription. Final represents the integration of identified transcripts in Aam and Aas.

3 討論與結(jié)論

前期研究中，筆者所在團隊基于二代短讀段數(shù)據(jù)對球囊菌菌絲和孢子轉(zhuǎn)錄組中的表達基因進行了定量和比較分析，分別檢測到7 557和7 640個表達基因，篩選出7 362個共有表達基因以及195和278個特有表達基因，并鑒定到977個上調(diào)基因和687個下調(diào)基因(蔣海賓等, 2020)。由于二代測序產(chǎn)生的短讀段限制，無法對轉(zhuǎn)錄本進行結(jié)構(gòu)、精確定量和差異表達分析。同一個基因轉(zhuǎn)錄而來的前體mRNA(pre-mRNA)通過AS可形成不同的剪接異構(gòu)體，最終形成不同的蛋白質(zhì)而表現(xiàn)出不同的表型(Modrek and Lee, 2002; Wangetal., 2008)。

相對于菌絲，真菌孢子是一種休眠態(tài)，僅保持低水平的新陳代謝和生命活動(Liuetal., 2016)。本研究利用已獲得的Nanopore長讀段測序數(shù)據(jù)對Aam和Aas中表達的轉(zhuǎn)錄本進行定量，結(jié)果顯示Aam中全長轉(zhuǎn)錄本的CPM值介于0.0010～76 721.3655(表1)，而Aas中全長轉(zhuǎn)錄本的CPM值介于0.0010～20 116.2770(表2)，說明球囊菌菌絲中全長轉(zhuǎn)錄本的整體表達水平更高，與實際情況相符。此前，我們利用二代測序技術(shù)在球囊菌孢子中鑒定到392個miRNA(陳華枝等, 2020b)、850個lncRNA(陳華枝等, 2021c)和2 995個circRNA(陳華枝等, 2021b)，并對部分ncRNA的表達進行了驗證，結(jié)果說明球囊菌孢子中存在一定水平的基因轉(zhuǎn)錄活動。 本研究的結(jié)果進一步提供了球囊菌孢子中存在轉(zhuǎn)錄活動的證據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，部分轉(zhuǎn)錄本在菌絲中特異性高表達，例如ONT.1954.6(CPM=1 421.3261), ONT.5520.1(CPM=6 245.3525)和ONT.7176.1(CPM=2 651.4502)等；部分轉(zhuǎn)錄本在孢子中特異性高表達，例如ONT.7346.1(CPM=20 116.2770), ONT.2508.21(CPM=17 482.8947)和ONT.2150.1(CPM=16 328.9977)等；且ONT.705.2, ONT.2558.1和ONT.4966.2等轉(zhuǎn)錄本同時在菌絲和孢子中高量表達。推測菌絲中特異性高表達的轉(zhuǎn)錄本與菌絲的生長和發(fā)育息息相關(guān)，孢子中特異性高表達的轉(zhuǎn)錄本與孢子的萌發(fā)和生長存在密切關(guān)系，而菌絲和孢子均維持高量表達的轉(zhuǎn)錄本在球囊菌生活史的不同階段皆發(fā)揮必要功能。相較于孢子，球囊菌菌絲中分別有3 072和158條全長轉(zhuǎn)錄本上調(diào)和下調(diào)表達，上調(diào)轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量遠多于下調(diào)轉(zhuǎn)錄本，說明多數(shù)轉(zhuǎn)錄本在菌絲中的表達更為活躍，與實際情況相符。本研究還發(fā)現(xiàn)一些轉(zhuǎn)錄本上調(diào)和下調(diào)的幅度很大，例如ONT.4715.1[Aam中CPM=75 415.9773, Aas中CPM=11.0906, log2(fold change)=14.4956]和ONT.2430.18[Aam中CPM=1.5644, Aas中CPM=364.8805，log2(fold change)=-5.9176]等，鑒于這些轉(zhuǎn)錄本在球囊菌菌絲和孢子中均維持不低的表達量，值得進一步深入研究。

球囊菌在增殖過程中需要從外界攝取多種碳源、氮源、維生素和礦質(zhì)元素，其中果糖和葡萄糖分別是球囊菌菌絲體生長和雜交產(chǎn)孢的最佳碳源(梁勤等, 2001)。真菌能通過糖酵解途徑將攝取到的葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸，從而滿足自身生長的能量需求(劉天明等, 2008)。因此，球囊菌在菌絲生長過程中必然進行活躍的營養(yǎng)攝取和能量轉(zhuǎn)化活動。糖酵解與糖異生途徑是方向相反的兩個能量代謝途徑，二者的多數(shù)酶促反應(yīng)可逆。糖異生是一種從氨基酸或三羧酸(TCA)循環(huán)的中間體等非碳水化合物底物中生成葡萄糖或糖原的代謝過程，在生物體發(fā)育和適應(yīng)營養(yǎng)饑餓方面發(fā)揮著重要作用(Marreroetal., 2010)。真菌在面對葡萄糖或其他碳源不足時能夠通過糖異生途徑維持自身發(fā)育所需的能量，并在侵染期間通過該途徑應(yīng)對攝取外源營養(yǎng)不足等情況(Brakhage, 2013)。Liu等(2018)研究發(fā)現(xiàn)糖異生途徑相關(guān)的PCK1基因可啟動灰霉菌Botrytiscinerea分生孢子萌發(fā)和侵染結(jié)構(gòu)形成等過程，并協(xié)助灰霉菌侵染寄主細(xì)胞以及增強病原毒力。本研究中，64條DETs同時注釋到糖酵解/糖異生相關(guān)通路，包括62條上調(diào)轉(zhuǎn)錄本(ONT.1193.1, ONT.1218.4和ONT.29.1等)以及2條下調(diào)轉(zhuǎn)錄本(ONT.7961.1和ONT.7961.5)(圖3)，上調(diào)轉(zhuǎn)錄本數(shù)量遠高于下調(diào)轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量，暗示球囊菌菌絲可通過上調(diào)表達糖酵解/糖異生途徑相關(guān)轉(zhuǎn)錄本，影響自身能量轉(zhuǎn)化過程，以滿足其旺盛的代謝活動需要。但由于糖酵解和糖異生在KEGG數(shù)據(jù)庫中的pathway信息為糖酵解/糖異生，所以尚無法區(qū)分分別注釋到糖酵解和糖異生的DETs。

內(nèi)吞作用涉及細(xì)胞的生長和分化以及分子信號傳遞。真菌菌絲可通過內(nèi)吞作用將酶類與質(zhì)膜等關(guān)鍵分子運送至菌絲頂端和其他部位以促進菌絲生長和極性延伸(Wangetal., 2019)。羅伯茨綠僵菌Metarhiziumrobertsii體內(nèi)的MrArk1作為內(nèi)吞作用的關(guān)鍵調(diào)控因子參與分生孢子和毒力水平的調(diào)節(jié)過程(Wangetal., 2019)。稻瘟病菌Magnaportheoryzae內(nèi)吞作用基因MoARK1和MoPAN1可顯著影響其細(xì)胞壁完整性、產(chǎn)孢量以及致病性(王佳妹, 2012)。但內(nèi)吞作用在球囊菌增殖過程中的生物學(xué)功能目前仍未明確。在球囊菌侵染蜜蜂幼蟲腸道過程中，其菌絲分泌各類水解酶抑制或降解宿主的防御因子，并吸收利用宿主的營養(yǎng)物質(zhì)以促進生長過程(Jensenetal., 2013)。本研究發(fā)現(xiàn)ONT.5566.7, ONT.5566.3, ONT.4500.10和ONT.1179.1等26條全長轉(zhuǎn)錄本注釋到內(nèi)吞作用(圖3)，且在Aam中均為上調(diào)表達。推測上述內(nèi)吞作用相關(guān)全長轉(zhuǎn)錄本在促進菌絲生長方面發(fā)揮一定作用，并與病原毒力水平存在潛在關(guān)聯(lián)。

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)級聯(lián)反應(yīng)可引起下游靶基因的表達變化，參與真菌細(xì)胞壁完整性、交配繁殖、孢子形成以及致病性等方面的調(diào)控過程(Zhaoetal., 2007; Igbariaetal., 2008)。新月彎孢菌Curvularialunata的MAPK信號通路相關(guān)基因Clk1和Clm1分別與病原孢子形成以及細(xì)胞壁形成密切相關(guān)(Nietal., 2018)。筆者所在團隊前期利用二代測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)球囊菌菌絲和孢子中的lncRNA和circRNA差異表達，并分別通過順式(cis)作用和調(diào)控來源基因轉(zhuǎn)錄，影響MAPK信號通路相關(guān)基因的表達(陳華枝等, 2021b, 2021c)。本研究發(fā)現(xiàn)5條上調(diào)轉(zhuǎn)錄本(ONT.1358.7, ONT.1474.3, ONT.750.14, ONT.750.2和rna3824)以及2條下調(diào)轉(zhuǎn)錄本(ONT.5822.1和rna735)皆可注釋到MAPK信號通路(圖3)。其中，ONT.750.14和ONT.750.2可同時注釋到內(nèi)吞作用和MAPK信號通路(圖3)。上述結(jié)果表明MAPK信號通路相關(guān)全長轉(zhuǎn)錄本可能與球囊菌的孢子形成、細(xì)胞壁完整性維持以及雜交產(chǎn)孢密切相關(guān)。

三代測序技術(shù)為深入研究轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)提供了強大工具(Boldogk?ietal., 2018, 2019)?；诙套x段測序數(shù)據(jù)只能進行基因表達量的計算和差異表達分析，但基于三代長讀段測序數(shù)據(jù)不僅能夠同時進行基因和轉(zhuǎn)錄本表達量的計算和差異表達分析，還能對基因(轉(zhuǎn)錄本)的結(jié)構(gòu)進行精確的AS和APA分析(Abdel-Ghanyetal., 2016; Moldovánetal., 2018)。相對于較早出現(xiàn)的PacBio SMRT測序技術(shù)，Nanopore長讀段測序技術(shù)由于誕生較晚，在轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)方面相關(guān)研究還較為有限。本研究發(fā)現(xiàn)，部分來源于同一基因的剪接異構(gòu)體在球囊菌菌絲和孢子中具有不同的結(jié)構(gòu)，例如全長轉(zhuǎn)錄本ONT.3612.1在菌絲和孢子中經(jīng)過AS形成兩條表達量和結(jié)構(gòu)均不同的剪接異構(gòu)體ONT.2373.1和ONT.3407.1(圖4)，表明球囊菌在生長和發(fā)育階段不僅伴隨著轉(zhuǎn)錄本表達量的變化，同時也伴隨著轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)的改變；同一基因來源的全長轉(zhuǎn)錄本在菌絲和孢子中經(jīng)歷不同的AS，形成具有不同結(jié)構(gòu)的剪接異構(gòu)體。這為深入理解球囊菌的菌絲生長、孢子萌發(fā)和有性生殖提供了一個嶄新的維度，也為其他物種的轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究提供了可供參考的思路和方法。

球囊菌的轉(zhuǎn)基因操作技術(shù)平臺缺失導(dǎo)致其基因(剪接異構(gòu)體)功能研究嚴(yán)重滯后。近期，Tauber等(2020)通過體外轉(zhuǎn)錄合成Ras家族編碼基因和β-葡聚糖合成蛋白編碼基因的雙鏈RNA(dsRNA)并處理球囊菌，發(fā)現(xiàn)球囊菌孢子可能在萌發(fā)早期吸收上述dsRNA，孢子萌發(fā)率明顯降低。該研究為深入開展球囊菌的基因(剪接異構(gòu)體)的功能研究提供了方法借鑒。