H9N2亞型禽流感病毒分離鑒定及免疫試驗(yàn)

許佳敏 邊海霞

摘要：為了更好防控H9N2亞型禽流感，且做到科學(xué)免疫，免疫減負(fù)。本研究采集疑似感染低致病禽流感雞群病料，將其無(wú)菌處理后接種SPF雞胚后進(jìn)行病毒分離，通過(guò)分子生物學(xué)試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行病原學(xué)鑒定。結(jié)果顯示：分離鑒定出一株H9亞型禽流感病毒（AIV）；血凝試驗(yàn)（HA）效價(jià)在10～11，該病毒屬于歐亞分支的BJ亞分支。將病毒純化后，制備滅活疫苗免疫SPF雞，免疫后14d對(duì)其進(jìn)行HI檢測(cè)，結(jié)果顯示其效價(jià)到達(dá)峰值為10Log2，免疫后28～35d其平均效價(jià)在9.6Log2，至免疫后12周平均效價(jià)在7Log2。結(jié)果說(shuō)明本研究分離的病毒制備成疫苗后具有較好的免疫效果，可以作為疫苗候選株。

關(guān)鍵詞：H9N2亞型禽流感毒株，免疫，疫苗

禽流感是禽流行性感冒（avian Influenza，AI）的簡(jiǎn)稱，是由正粘病毒科（orthomyxoviridae）、流感病毒屬（influenza virus）、A型流感病毒（influenza A virus）引起的禽類疾病[1]。國(guó)際獸醫(yī)局（OIE）將禽流感列為A類動(dòng)物疫病，我國(guó)也將其定為一類動(dòng)物傳染病。

H9N2禽流感病毒是低致病性亞型，在世界各地家禽群中流行。目前，H9N2引起的禽流感在我國(guó)呈地方流行，雖然死亡率低，但感染蛋雞出現(xiàn)雞輸卵管功能異常，產(chǎn)褪色蛋、畸形蛋、砂皮蛋、軟殼蛋，雞群產(chǎn)蛋率下降30%～80%，病程持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的可達(dá)月余，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。該疾病可通過(guò)免疫疫苗進(jìn)行抵御但是由于低致病禽流感變異速度快，不同血清型之間交叉保護(hù)有限；所以篩選、免疫對(duì)型疫苗對(duì)養(yǎng)殖業(yè)具有重要意義[3]。本研究通過(guò)分子病原學(xué)及血清學(xué)分離鑒定一株H9N2流行毒株，并進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，為進(jìn)一步篩選疫苗提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料來(lái)源疑似發(fā)病雞病料，采集自寧夏平羅縣某商品蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.2試劑和設(shè)備禽流感抗H9亞型標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所提供；OneStepPCRMix購(gòu)自北京全式金生物；PCR儀購(gòu)自羅氏；RNA提取試劑盒購(gòu)自羅氏；高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自湘儀。

1.1.3試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)用SPF雞種蛋，購(gòu)自北京勃林格英格翰公司

1.1.4引物設(shè)計(jì)參照GenBank中已發(fā)表的H9N2AIV的HA基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)鑒定引物，序列為：AI-F（5-3）：CTCCACACAGAGCAYAATGG；AI-R（5-3）：GYACACTTGTTGTTGTRTC；擴(kuò)增基因片段大小均為488bp。測(cè)序引物系列：HA-F（5-3）：AGCRAAAGCAGGGGAATTTC；HA-R（5-3）：AGTAGAAACAAGGGTGTTTT；擴(kuò)增基因片段大小均為1800bp。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.2方法

1.2.1病毒基因組RNA提取采集疑似發(fā)病雞群病料及肛咽拭子；將其無(wú)菌處理后，根據(jù)羅氏病毒RNA提取試劑盒操作步驟，提取核酸。使用鑒定引物根據(jù)全式金生物一步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃2min；94℃30s，53℃30s，72℃2min，30個(gè)循環(huán)； 72℃10min；擴(kuò)增完畢后進(jìn)行凝膠電泳，觀察是否有目的片段。

1.2.2病毒分離及鑒定將1.2.1無(wú)菌處理的肛咽拭子樣品吸取上清，使用0.22μm濾器過(guò)濾，以0.2mL/只接種9～10日齡SPF雞胚，棄去24h內(nèi)死亡雞胚，將24～96h死亡和存活雞胚放于4℃過(guò)夜或放于-20℃2h后無(wú)菌收集尿囊液。檢測(cè)尿囊液效價(jià)，對(duì)于有效價(jià)尿囊液重復(fù)1.2.1操作，擴(kuò)增完畢后進(jìn)行凝膠電泳，觀察是否有目的片段；無(wú)效價(jià)尿囊液重復(fù)接種雞胚。

1.2.3序列測(cè)定、同源性分析將含有目的片段的PCR產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)整理、拼接，獲得完整的HA基因序列。利用MEGA4及MegAlign軟件進(jìn)行分析。

1.2.4免疫血清的制備將收獲的雞胚尿囊液按油乳劑疫苗的制備方法制備滅活疫苗，檢驗(yàn)合格后，經(jīng)胸肌接種20只21日齡SPF雞，0.5mL/只，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。于免疫后2周、4周、6周、8周、12周采血，分離血清，分別保存?zhèn)溆谩?/p>

2結(jié)果

2.1 PCR反應(yīng)與序列鑒定

病料樣品處理后接種9～10日齡SPF雞胚，在培養(yǎng)的72h內(nèi)未出現(xiàn)雞胚死亡，72h后測(cè)其尿囊液，HA效價(jià)為10log2，并且HA陽(yáng)性尿囊液的血凝性能夠被AIV-H9標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清所抑制，而不能被抗NDV、EDSV、AIV-H5陽(yáng)性血清所抑制，表明該分離株為H9亞型AIV。進(jìn)一步利用H9鑒定引物對(duì)分離株HA基因進(jìn)行擴(kuò)增，得到與預(yù)期大?。s488bp）相符片段（見(jiàn)圖1）。同時(shí)利用測(cè)序引物進(jìn)行擴(kuò)增送至上海生工技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，與其匹配度高的幾種序列全部為H9亞型禽流感序列，根據(jù)MEGA4及MegAlign軟件分析，結(jié)果顯示該病毒與歐亞BJ亞分支同源性99.8%～95.0%，進(jìn)一步證實(shí)該分離株為H9亞型禽流感。

2.5免疫試驗(yàn)結(jié)果

免疫后2周抗體效價(jià)上升至10Log2，顯著高于國(guó)標(biāo)的6.5log2，免疫后4～5周抗體效價(jià)維持在9.6Log2滴度，具有較好的保護(hù)力度。隨后抗體效價(jià)逐漸消減，至免疫后12周抗體效價(jià)水平維持在7Log2。

3討論

1994年，我國(guó)分離到第一株H9N2亞型禽流感病毒后，H9N2亞型禽流感病毒在我國(guó)禽類中廣泛流行，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[4]。雞群感染H9亞型禽流感后產(chǎn)蛋率下降較明顯，所以養(yǎng)殖業(yè)對(duì)H9亞型禽流感病毒的防控十分重視。本試驗(yàn)通過(guò)病毒分離，血清學(xué)試驗(yàn)為選用H9疫苗提供依據(jù)，同時(shí)為防控H9N2亞型禽流感提供新思路。█

參考文獻(xiàn)：

[1]于力，于康震，徐宜為.動(dòng)物傳染病學(xué)[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1999.

[2]孫泉云，陳琦，夏爐明.H9N2亞型禽流感流行現(xiàn)狀[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011（10）： 107-111.

[3]欒棟祖，王淑平，臧金來(lái)，等.肉雞溫和型禽流感（H9N2）的防治[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2009，26（8）：53-54.

[4]劉紅旗，劉秀梵，張如寬.A型流感病毒蛋白研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2002，23（2）：6-9.