龍生蛭膠囊治療高甘油三酯血癥的作用與機(jī)制研究

黃 鈺,趙 虔,蘇佳敏,趙步長(zhǎng),楊瀟瀟,韓際宏

(1.合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601; 2.合肥工業(yè)大學(xué) 重大疾病代謝及營(yíng)養(yǎng)調(diào)控安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安徽 合肥 230601; 3.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司,陜西 西安 712000)

高甘油三酯血癥(hypertriglyceridemia)作為常見高脂血癥之一,與動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、肥胖癥、糖尿病、胰腺炎等多種疾病相關(guān)[1],甘油三酯(triglyceride,TG)合成、代謝途徑異常是誘發(fā)高甘油三酯血癥的主要因素。近年來,綜合流行病學(xué)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，中度和重度高甘油三酯血癥與心血管疾病患病風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。血漿中的TG主要存在于極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)和乳糜微粒(chylomicron,CM)中,VLDL和CM又被稱為富含甘油三酯的脂蛋白(triglyceride-rich lipoprotein,TRL),因此血漿中TG的水平間接反映了TRL的含量。TRL不僅能穿過動(dòng)脈內(nèi)膜,還可以與動(dòng)脈壁結(jié)締組織結(jié)合并在動(dòng)脈內(nèi)壁富集,而這些脂蛋白在動(dòng)脈壁的積累是巨噬細(xì)胞發(fā)生泡沫化的誘因之一,因此TRL水平的增加是促進(jìn)巨噬細(xì)胞泡沫化和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的重要因素[2]。TRL水平的升高也被認(rèn)為與冠狀動(dòng)脈、頸動(dòng)脈疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[3]。此外,高甘油三酯血癥還會(huì)導(dǎo)致高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)的減少和低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)的增加,并且還可以通過產(chǎn)生過多的游離脂肪酸,促進(jìn)炎癥因子、凝血因子的釋放,進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的病程[4-8]。

甘油三酯的合成分為脂肪酸的合成和甘油三酯的合成。在胞質(zhì)中,乙酰輔酶A羧化酶利用乙酰輔酶A合成丙二酰輔酶A,這是脂肪酸合成的起始步驟,接著脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)催化脂肪鏈的延長(zhǎng),其產(chǎn)物最終進(jìn)入甘油三酯的合成途徑。甘油三酯的合成以甘油作為前體,C-3位被磷酸化之后起始甘油三酯的合成,催化甘油三酯合成關(guān)鍵酶包括甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶、乙酰甘油磷酸?；D(zhuǎn)移酶和二酰基甘油?；D(zhuǎn)移酶[9-10]。甘油三酯的水解主要發(fā)生在脂肪細(xì)胞中,首先在甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase, ATGL)作用下水解成甘油二脂和一分子脂肪酸[11],然后在激素敏感性脂肪酶和單甘油酯脂肪酶作用下水解成甘油和游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)[12],并且ATGL與其共激活因子-58(comparative gene identification-58,CGI-58)結(jié)合之后,其活性會(huì)增加20多倍[13]。

生蛭膠囊(國藥準(zhǔn)字 Z20010059)是由陜西步長(zhǎng)制藥有限公司生產(chǎn),主要成分包括黃芪、水蛭、川芎、當(dāng)歸、紅花、桃仁、赤芍、木香、石菖蒲、地龍、桑寄生、刺五加浸膏等12種中草藥材料。目前已經(jīng)鑒定出龍生蛭膠囊中的多種活性物質(zhì)具有心血管保護(hù)作用,例如檸檬酸、沒食子酸、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、大豆皂苷Ⅰ、槲皮素、山奈酚、鵝掌楸甙被證明具有抗氧化和抗炎活性[14-17],兒茶素是龍生蛭膠囊中另一種活性成分,研究表明口服兒茶素可以顯著降低膽固醇的合成,同時(shí)上調(diào)LDLR表達(dá)增加膽固醇代謝[18];龍生蛭膠囊中還有一些其他組分(包括苦杏仁苷、沒食子酸乙酯和芝麻素等)在動(dòng)物模型中可以發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用,例如從水蛭唾液腺中提取的水蛭素可以通過改善脂代謝和降低血清中炎性細(xì)胞因子水平,抑制apoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成[19]。

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)龍生蛭膠囊能夠抑制apoE基因敲除小鼠中動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[20]。臨床表明龍生蛭膠囊具有降低血脂的作用,為進(jìn)一步探究龍生蛭膠囊在高甘油三酯血癥中是否發(fā)揮積極的保護(hù)作用,本文采用C57BL/6小鼠開展體內(nèi)研究,探索龍生蛭膠囊的抗高甘油三酯作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞

SPF級(jí)C57BL/6J小鼠,6～8周齡,購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào)為SCXK(京)2016-0006。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞為人源肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞。

1.2 藥物與試劑

龍生蛭膠囊(陜西步長(zhǎng)制藥有限公司),CHO、TG、LDL-C、HDL-C試劑盒(美康生物科技股份有限公司),組織甘油三酯檢測(cè)試劑盒(日本W(wǎng)AKO公司,貨號(hào)290-63701),游離脂肪酸檢測(cè)試劑盒(Solarbio,貨號(hào)BC0595),組織總膽固醇測(cè)定試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司,貨號(hào)E1015),油紅O染料(Solarbio,貨號(hào)O8010), SYBR Green Master Mix(Vazyme,貨號(hào)Q111-03)ox-LDL(奕元生物),總RNA提取劑(ZOMANBIO,貨號(hào)7BA02F8),DMEM培養(yǎng)基(Corning Subsidiary,貨號(hào)27017008)。

2 方 法

2.1 龍生蛭的萃取

取龍生蛭膠囊粉末21.84 g,加入350 mL 無水乙醇回流提取4 h,取得的提取液經(jīng)布氏漏斗抽提,留存濾液,55 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(水浴加熱),去除殘留的有機(jī)溶劑后,于真空干燥箱烘干,得4.5 g醇提物,可求出醇提物得率為20.6%。醇提物得率的計(jì)算公式為:

(1)

2.2 細(xì)胞的處理及油紅O染色

HepG2細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,50 μg/mL 1×Penicillin)培養(yǎng),待細(xì)胞長(zhǎng)滿后,分至預(yù)先鋪好片的24孔板中,每孔5×104個(gè)細(xì)胞,用500 μmol/L的油酸與0、0.5、2.0、5.0 μg/mL的龍生蛭提取物共同孵育24 h。配制0.5%油紅O染液原液,用原液與蒸餾水體積比為3∶2稀釋后過濾備用。將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min,固定之后清洗2遍,每孔加入300 μL 0.3%油紅O染液室溫染色1 h,用60%異丙醇脫色,再用蘇木素染液進(jìn)行細(xì)胞核染色,封片干燥后拍照。

2.3 動(dòng)物的分組及給藥處理

購買6～8周齡C57BL/6J小鼠24只,用普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后將小鼠分為3組(每組8只小鼠),分別為對(duì)照組、龍生蛭低劑量組、龍生蛭高劑量組。對(duì)照組喂食高脂飼料(D12107C)[21],配方見表1所列,給藥組喂食含有龍生蛭的高脂飼料,低劑量組為每100 g高脂食物中含850 mg龍生蛭,高劑量組為每100 g高脂食物中含2 g龍生蛭。喂食2周后,安樂處死小鼠,取血,靜置2 h后2 000g室溫離心20 min,取上層血清-80 ℃保存。取肝,在肝臟最大一葉取一塊組織在多聚甲醛中固定24 h以上,再轉(zhuǎn)移至30%蔗糖溶液中脫水,稱取30 mg組織用于提取RNA,余下組織-80 ℃保存。

表1 高脂飼料配方 g

2.4 生化指標(biāo)的測(cè)定

將血清從-80 ℃冰箱取出,待融化后轉(zhuǎn)移75 μL至新管,用1×PBS等體積稀釋,混勻后用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清TG、總膽固醇(CHO)、LDL-C、HDL-C。

2.5 肝臟冷凍切片及油紅O染色

組織在30%蔗糖溶液中脫水24 h以上,取出將組織塊修平,用組織包埋劑包埋,置于冷凍切片機(jī)中完全凍實(shí)后再進(jìn)行切片,切片厚度為5 μm。將組織切片放在染缸里用0.3%油紅O染液染色1 h,再用蘇木素染液染色細(xì)胞核,鏡下觀察、拍照。

2.6 肝臟組織TG、CHO、FFA的測(cè)定

肝臟組織TG、CHO、FFA均采用試劑盒法測(cè)定,樣品處理、標(biāo)準(zhǔn)曲線及工作液配制均按試劑盒說明操作,最后用酶標(biāo)儀測(cè)定讀取吸光度并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度,同時(shí)用蛋白濃度進(jìn)行數(shù)據(jù)校準(zhǔn)。

2.7 組織總RNA的提取及qPCR檢測(cè)

30 mg肝臟組織加入500 μL RNA提取劑,加入鋼珠,使用高通量組織研磨儀研磨5 min,頻率為50 Hz。磨完后取出鋼珠,在勻漿液中加入100 μL三氯甲烷,混勻后于4 ℃,12 000 r/min,離心5 min,將上清轉(zhuǎn)移至新管,再加入等體積異丙醇,-20 ℃過夜沉降。次日取出離心,棄上清,依次用75%乙醇和100%乙醇洗滌RNA,洗后徹底晾干,向管中加入60 ℃無菌水溶解RNA,通過分光光度計(jì)測(cè)RNA濃度,取1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time Quantitative polymerase chain reaction,qPCR),引物信息見表2所列。

表2 引物序列

2.8 小鼠肝臟組織蛋白Western Blot實(shí)驗(yàn)

30 mg肝臟組織加入500 μL RNA提取劑,加入鋼珠,使用高通量組織研磨儀研磨5 min,頻率為50 Hz。磨完后取出鋼珠,4 ℃離心10 min,上清液即為蛋白溶液,BCA法測(cè)蛋白濃度,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。將目的條帶分別用一抗、二抗孵育,然后進(jìn)行曝光。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 龍生蛭抑制HepG2細(xì)胞中脂質(zhì)的積累

肝細(xì)胞脂質(zhì)積累是高甘油三酯血癥發(fā)生的重要因素[22],為探究龍生蛭膠囊是否能抑制肝細(xì)胞中脂質(zhì)積累,用油酸(OA)刺激HepG2細(xì)胞,誘導(dǎo)細(xì)胞脂質(zhì)積累模型[23],再用不同質(zhì)量濃度的龍生蛭進(jìn)行干預(yù),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 龍生蛭膠囊抑制HepG2細(xì)胞中脂質(zhì)的積累情況

由圖1可知, 對(duì)照組(龍生蛭質(zhì)量濃度為0)HepG2細(xì)胞中經(jīng)過油酸誘導(dǎo)脂滴積累較為嚴(yán)重,圖1a箭頭指示部分為脂滴;當(dāng)龍生蛭質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL時(shí)細(xì)胞中脂滴積累明顯減少;當(dāng)龍生蛭質(zhì)量濃度達(dá)到5.0 μg/mL時(shí)幾乎看不到細(xì)胞中有脂滴。結(jié)果表明當(dāng)龍生蛭質(zhì)量濃度為5 μg/mL時(shí)能較好地抑制HepG2細(xì)胞中脂質(zhì)的積累,暗示其具有抑制脂質(zhì)積累、合成的潛在可能。

3.2 龍生蛭膠囊改善小鼠肝臟脂質(zhì)的積累

為探究龍生蛭膠囊在小鼠體內(nèi)是否也能抑制肝臟和血清中的脂質(zhì)積累,本文通過高脂食物喂食誘導(dǎo)C57BL/6小鼠高甘油三酯血癥,同時(shí)給予小鼠不同劑量的龍生蛭膠囊喂食,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后安樂處死小鼠,進(jìn)行肝臟冰凍切片油紅染色,結(jié)果如圖2所示,從圖2可以看出,對(duì)照組小鼠肝臟中脂滴積聚較為明顯,龍生蛭低劑量組小鼠肝臟中脂滴未明顯減少,但高劑量組小鼠肝臟中脂滴積累明顯得到改善。

為進(jìn)一步探究龍生蛭膠囊影響了肝臟中何種脂質(zhì)成分的累積,試劑盒定量檢測(cè)了肝臟中CHO、TG和FFA,通過t檢驗(yàn)分析各組之間差異,結(jié)果如圖3所示。

圖2 龍生蛭膠囊改善小鼠肝臟中脂質(zhì)的積累情況

圖3 龍生蛭膠囊對(duì)小鼠肝臟中CHO、TG和FFA的影響

由圖3可知,龍生蛭膠囊對(duì)肝臟中總膽固醇和游離脂肪酸的量并無明顯影響,但顯著降低了小鼠肝臟中甘油三酯的量,t檢驗(yàn)分析低劑量組與對(duì)照組肝臟中甘油三酯量的差異(*表示P<0.05),高劑量組與對(duì)照組肝臟中甘油三酯量的差異(** 表示P<0.01),結(jié)果表明龍生蛭能夠顯著降低小鼠肝臟中甘油三酯的量,暗示其具有抗高甘油三酯血癥的作用。

3.3 龍生蛭膠囊對(duì)小鼠血清中TG水平的影響

龍生蛭膠囊能夠明顯降低小鼠肝臟中TG的量,為了研究龍生蛭膠囊對(duì)血清中TG水平的影響,提取小鼠血清,通過生化分析儀檢測(cè)了小鼠血清中CHO、TG、LDL-C、HDL-C水平,結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知,龍生蛭膠囊能夠顯著抑制血清中TG的水平(**表示P<0.01)，但龍生蛭膠囊對(duì)膽固醇則無明顯作用(圖4b)。

圖4 龍生蛭膠囊對(duì)血清中TG、CHO、LDL-C、HDL-C的影響

3.4 龍生蛭膠囊降低甘油三酯的分子機(jī)制

為探究龍生蛭膠囊降低甘油三酯的分子機(jī)制,采用qRT-PCR的方法檢測(cè)了甘油三酯代謝相關(guān)的基因表達(dá),包括FASN、DGAT1、ATGL、CGI-58、LPL、MTTP,結(jié)果如圖5所示。

從圖5可以看出,龍生蛭膠囊能顯著下調(diào)甘油三酯合成關(guān)鍵基因FASN、DGAT1的mRNA水平(**表示P<0.01),上調(diào)脂蛋白酯基因LPLmRNA的表達(dá)(*表示P<0.05),但是對(duì)CGI-58、ATGL、MTTP的mRNA表達(dá)并沒有明顯的影響。

本文進(jìn)一步通過Western Blot檢測(cè)龍生蛭膠囊能抑制小鼠肝臟中FASN的蛋白表達(dá)如圖6所示,圖6中,*表示P<0.05,**表示P<0.01。

由圖6可知,龍生蛭膠囊通過抑制TG的合成同時(shí)促進(jìn)TG的水解,進(jìn)而發(fā)揮降低小鼠肝臟和血清中TG水平的作用。

圖5 龍生蛭膠囊對(duì)甘油三酯代謝相關(guān)基因的影響

圖6 龍生蛭膠囊對(duì)小鼠肝臟中FASN蛋白表達(dá)的影響

4 結(jié) 論

隨著人們生活水平的提高和人口的老齡化,高甘油三酯的發(fā)病率逐年增長(zhǎng),血液中甘油三酯水平的升高已被確認(rèn)為是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[24]。臨床上治療高甘油三酯的藥物主要是煙酸和貝特類,這2種藥物降脂效果明確,但也存在肝損傷、白細(xì)胞減少等一些潛在的毒副作用[25]。中國擁有豐富的中草藥資源,目前來說,中藥抗高甘油三酯還存在著有效成分不清楚,作用靶點(diǎn)不明確等問題。本文利用先進(jìn)的醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù),從分子層面揭示了龍生蛭膠囊治療高甘油三酯的作用機(jī)制,為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

本文首先從細(xì)胞水平分析龍生蛭膠囊是否能抑制細(xì)胞中脂質(zhì)的積累,發(fā)現(xiàn)龍生蛭膠囊能較好地降低細(xì)胞中脂質(zhì)的含量。采用高脂食物誘導(dǎo)小鼠高甘油三脂血癥模型,同時(shí)用龍生蛭治療,通過小鼠肝臟冰凍切片油紅O染色和脂質(zhì)定量分析、血清脂質(zhì)檢測(cè)顯示:龍生蛭膠囊能夠顯著降低小鼠肝臟和血清中甘油三酯的量,表明其具有抗高油三脂血癥的積極作用。

龍生蛭膠囊中含有水蛭素、沒食子酸、槲皮素、兒茶素、芝麻素等具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的活性物質(zhì),例如沒食子酸能增強(qiáng)ATGL的表達(dá)來加速脂質(zhì)代謝,從而降低高脂飲食大鼠腎周脂肪組織中的高血糖和脂肪積累[26]；芝麻素通過氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPAR-α)途徑,提高了肝臟脂肪酸氧化酶的活性,加速了脂肪酸的氧化速率[27]。為了確定龍生蛭膠囊降低甘油三酯的分子機(jī)制,進(jìn)一步采用qPCR的方法定量檢測(cè)了甘油三酯合成和分解代謝關(guān)鍵酶的表達(dá)水平,結(jié)果表明龍生蛭膠囊能抑制甘油三酯合成關(guān)鍵基因FASN、DGAT1的表達(dá),同時(shí)上調(diào)甘油三酯水解關(guān)鍵基因LPL的表達(dá),這說明了龍生蛭膠囊中的活性成分影響了甘油三酯合成途徑來降低TG的合成,同時(shí)促進(jìn)了TG的分解途徑增加TG的代謝水解,最終降低了小鼠肝臟和血清中甘油三酯的量。

綜上所述,本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了龍生蛭膠囊通過減少TG的合成,增加TG的水解來降低小鼠肝臟和血清中的TG水平,該研究有望為龍生蛭膠囊在臨床上應(yīng)用于治療高甘油三酯血癥提供理論依據(jù),為人類的健康提供幫助。