花青素納米纖維智能標簽對羊肉新鮮度的無損檢測

孫武亮，李文博，靳志敏，靳 燁，孫文秀※

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，呼和浩特 010018；2. 內(nèi)蒙古自治區(qū)市場監(jiān)督管理審評查驗中心，呼和浩特 010070）

0 引 言

近年來，隨著人們生活水平的提高，食品安全問題受到了廣泛重視。肉類可以為機體提供微量元素，是重要的礦物質(zhì)來源，已成為日常飲食中不可或缺的部分，所以對其安全性的控制與檢測尤為重要[1-2]。究其根本，要解決肉類安全性問題，首先要實現(xiàn)其新鮮度的實時檢測，這樣才能有效控制產(chǎn)品流通與銷售，進而達到提高肉類安全性指數(shù)的目的。肉類新鮮度級別由揮發(fā)性鹽基總氮含量（Total Volatile Basic Nitrogen，TVB-N）劃分，但傳統(tǒng)檢測方法過于復雜，且耗時較長，不能實現(xiàn)實時檢測。因此，為實現(xiàn)肉類新鮮度的無損及可視化檢測，讓普通大眾也可獲悉產(chǎn)品品質(zhì)優(yōu)異的目的，研究者們開始著眼于開發(fā)可對肉類特征性腐敗物質(zhì)具有響應(yīng)性的智能標簽。

目前，檢測肉類新鮮度的智能標簽大多是基于指示材料對包裝環(huán)境的pH值敏感性而制備的，其可以在不同pH值條件下顯示出不同顏色，進而實現(xiàn)新鮮度的分級與檢測[3-4]。隨著人們對肉類安全的重視，基于合成型pH敏感材料（二甲酚藍、溴甲酚綠、溴甲酚紫、甲酚紅、甲基紅和溴百里酚藍）和天然型敏感材料（花青素和茜素）的智能指示標簽均已被制備[4-9]。在這些研究中，雖然可以對肉類新鮮度進行無損、實時及可視化檢測，但大多只采用TVB-N和菌落總數(shù)進行新鮮度劃分，指標過于單一，準確性不高。并且這些新鮮度指標在與標簽顏色變化進行相關(guān)性分析時，也只是粗略的用肉類腐敗閾值和標簽顏色進行比對，不能實現(xiàn)對肉類剩余貨架期的預(yù)測。由此可見，肉類新鮮度的檢測及其剩余貨架期的預(yù)測尚不全面，準確性有待進一步驗證，不利于解決肉類安全問題。綜上所述，為實現(xiàn)肉類新鮮度較為準確的無損、實時及可視化檢測，以及剩余貨架期的預(yù)測，明確智能標簽顏色變化與新鮮度指標的關(guān)系，參考Sun等[10-11]制備的納米纖維膜方法，制備花青素納米纖維智能便簽應(yīng)用于羊肉新鮮度檢測中，結(jié)合方差分析和相關(guān)性分析，建立智能標簽對羊肉新鮮度的預(yù)測模型，為肉類新鮮度的無損、實時及可視化檢測開辟新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：納米纖維膜由Sun等[10]提供；羊肉來自內(nèi)蒙古烏拉特中旗蘇尼特羊育種園區(qū)，選取12月齡蘇尼特羊，于6:00吊掛屠宰，去除頭、蹄和內(nèi)臟后，迅速在胴體上取后腿肉100 g，迅速放入冰盒中，待用。

試劑：氨水、氧化鎂、硼酸、濃鹽酸，均為分析純；PCA（plate count agar）培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；甲基紅、溴甲基酚綠，麥克林試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

pH-STAR型胴體pH計，德國MATTHAUS公司；CR-20型色差計，日本柯尼卡美能達有限公司；Pro-Nitro A全自動凱氏定氮儀，北京金恒祥儀器有限公司；SEM4000掃描電鏡，日本JSM公司；UV-2450紫外分光光度計，島津企業(yè)管理（中國）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 納米纖維膜的制備

納米纖維膜的制備參考Sun等[10-11]的方法，稱取質(zhì)量分數(shù)為12%的聚乳酸（Polylactic Acid，PLA）置于二氯甲烷（Dichloromethane，DCM）溶液中，并在磁力攪拌器上以500 r/min持續(xù)攪拌直至PLA顆粒全部溶解；稱取質(zhì)量分數(shù)為0.4%的花青素溶于二甲基甲酰胺（N，N-Dimethylformamide，DMF）中，并在磁力攪拌器上以500 r/min持續(xù)攪拌直至花青素全部溶解，隨后將該溶液倒入PLA溶液中，充分混合制成紡絲溶液，其中DCM/DMF的質(zhì)量比為3∶2。

靜電紡絲步驟參考Sun等[10-11]的方法，將紡絲溶液注入到可以垂直沉降的注射器（體積為10 mL）中，將其放于靜電紡絲機中，選用五噴頭器件進行紡絲。紡絲參數(shù)為：正電壓為+ 20 kV；相對空氣濕度為20%；溶液的進料速度為1 mL/h；轉(zhuǎn)筒速度為150 r/min；纖維絲的空間積累距離為18 cm；空間積累時間為30 min。最后將所得的納米纖維膜放于50 ℃的真空干燥箱中干燥至恒質(zhì)量。

1.3.2 納米纖維膜的表征

1）掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）

通過掃描電子顯微鏡（SEM-TM4000Plus，Hitachi High-Technologies Corporation，Japan）研究花青素納米纖維膜的表面形貌特征。每幅圖像的最大施加電壓為15 kV，工作距離為1～5 mm。選用image pro 6plus作為SEM圖像的分析軟件。

2）胺敏感性

選用氨蒸汽作為模型氣體，采用頂空方法檢測膜的胺敏感性。依據(jù)亨利定律，氨蒸汽濃度通過容器中氨溶液的氣液平衡來控制[12-13]。傳感試驗在25 ℃下、相對濕度54%條件下進行，先向培養(yǎng)皿中注入15 mL濃度為1～100 mg/L的氨水，然后將膜（1 cm×2.5 cm）密封于其中，充分反應(yīng)24 h后，通過UV-2450紫外分光光度計測定膜的光學吸收變化。

1.3.3 納米纖維膜對羊肉新鮮度的檢測

選取羊后腿肉，放入超凈臺中紫外滅菌20 min，切除表面肉層，并將羊肉均分為25 g放于包裝盒中，將納米纖維膜（1 cm×2 cm）放于頂部，不接觸肉樣。試驗溫度選用大型超市的市售溫度（10±2 ）℃，纖維膜照片拍攝在燈的位置、入射角和強度恒定的燈箱中進行。每天測定感官品質(zhì)、TVB-N、菌落總數(shù)、pH值、酸度/氧化力系數(shù)和納米纖維膜的色差值ΔE，直至羊肉徹底腐敗變質(zhì)。每次試驗設(shè)置3個平行，重復進行3次，以驗證結(jié)果準確性。

感官評定：選10名經(jīng)過培訓的評價員對儲藏期間的羊肉進行感官評分，評分標準見表1[14]。

表1 羊肉感官評定表Table 1 Sensory evaluation table of mutton

TVB-N：參考GB 5009.228—2016的方法，利用全自動凱氏定氮法測定TVB-N含量，每個樣品測定3次取平均值。

菌落總數(shù)：參考GB 4789.2—2016的方法，選用平板計數(shù)法測定肉樣的菌落總數(shù)，每個樣品測定3次取平均值。

pH：使用胴體pH計測定羊肉pH值，每個樣品測定3次取平均值。

酸度/氧化力系數(shù)：參考朱民望[15]的方法，取10 g肉樣，去除筋膜，切成肉糜，加入90 mL蒸餾水，攪拌均勻后靜置30 min，過濾待用。取10 mL濾液，加入40 mL蒸餾水，混勻后滴加五滴酚酞試劑，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定，當樣液變?yōu)榈t色且半分鐘內(nèi)不褪色時，消耗的NaOH溶液體積即為酸度值。量取50 mL蒸餾水置于三角燒瓶中，依次加入5 mL 0.2 mol/L硫酸和1滴0.02 mol/L高錳酸鉀溶液，混合加熱至40～50 ℃，再加入10 mL肉樣濾液，立即用0.02 mol/L高錳酸鉀滴定，直至溶液呈玫瑰紅色且30 s內(nèi)不褪色即為滴定終點，所消耗的高錳酸鉀溶液的體積即為氧化力值。

納米纖維膜的色差：使用色差儀測定纖維膜的顏色，L*為亮度值，a*為紅度值，b*為黃度值，每個樣品測定3次取平均值。色差ΔE計算公式如下

式中L0*，a0*和b0*為纖維膜的初始顏色值，L*，a*和b*為纖維膜使用之后的值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析方法

使用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，使用Origin2018軟件進行作圖分析，選用Image plus pro6軟件測量纖維的直徑，采用JMP Pro 14軟件進行相關(guān)性分析、預(yù)測模型的建立和模型準確度的計算。模型準確度是預(yù)測為正實際為正和預(yù)測為負實際負占總樣本的比例。

2 結(jié)果與分析

2.1 納米纖維智能標簽的表征

由圖1可知，納米纖維智能標簽宏觀上呈淡粉色，且柔軟輕薄。由SEM的圖像證明，智能標簽微觀上由直徑約為250 nm的平滑、均勻和連續(xù)的納米纖維絲構(gòu)成，無明顯串珠現(xiàn)象。

2.2 胺敏感性

肉在腐敗過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體中，NH3、二甲胺和三甲胺是幾種主要的堿性特征性揮發(fā)性成分[16]。其中NH3是結(jié)構(gòu)最為簡單，且對環(huán)境pH值具有直接影響的氣體，所以選用該氣體作為檢測納米纖維智能標簽敏感性的模型氣體[17]。為測定納米纖維膜的胺敏感性，將膜暴露于氨溶液中（1～100 mg/L）過夜后，使用UV-2450紫外分光光度計確定粉色納米纖維復合膜的光學吸收變化，結(jié)果如圖2所示。花青素的紫外吸收峰在500～550 nm之間[18]，UV-2450紫外分光光度計檢測到納米纖維膜在533 nm處出現(xiàn)最大吸收峰。隨著氨濃度的增加，膜的吸收峰逐漸下降，當濃度大于70 mg/L時，最大吸收峰基本消失。此反應(yīng)的感應(yīng)機制為：納米纖維膜初始呈鮮艷的粉紅色；當暴露于氨蒸汽后，花青素中發(fā)生親核加成反應(yīng)，電子發(fā)生轉(zhuǎn)移，碳原子上的電子轉(zhuǎn)移到氧原子上，形成了碳正離子；碳正離子吸引游離的氫氧根，雙鍵斷裂成單鍵，最終形成半縮酮；半縮酮是一種無色物質(zhì)，其在一定溫度下吡喃環(huán)可以被打開，進而形成順式查爾酮結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)也是一種無色物質(zhì)[19-20]。綜上所述，納米纖維膜在533 nm的紫外吸光度與氨濃度呈反比關(guān)系（關(guān)系式為：y=0.907 06-0.003 8x，R2=0.989 7），證實了纖維膜從粉色變?yōu)榘咨梢员蝗庋圩R別，為后期膜在羊肉的新鮮度檢測應(yīng)用中提供依據(jù)。

2.3 納米纖維智能標簽對羊肉新鮮度的監(jiān)測

2.3.1 羊肉儲藏過程中新鮮度的分級

感官評定、pH值、TVB-N、菌落總數(shù)和酸度/氧化力系數(shù)是判定肉新鮮度的主要指標，通過測定羊肉儲藏過程中上述指標的變化，實現(xiàn)對羊肉新鮮度的準確分級，并將分級結(jié)果與納米纖維智能標簽的色彩變化對比，分析智能標簽對羊肉新鮮度檢測的準確性。

感官評定是通過氣味、色澤和組織狀態(tài)實現(xiàn)對肉新鮮度明確的分級，是最為直觀的判定方法。由表2可知，屠宰后的新鮮羊肉具有較好的風味和色澤、肌纖維致密有序、組織狀態(tài)較好，感官評分較高，具有較高的食用價值。隨著儲藏時間的增加，羊肉感官評分逐漸下降，在48 h時，羊肉的各項感官評分降至2.20～2.70之間，具體表現(xiàn)為輕微腐敗味的出現(xiàn)、色澤變?yōu)榘导t色、輕微的汁液流失、組織狀態(tài)松散，食用品質(zhì)明顯下降。當羊肉儲藏72 h時，出現(xiàn)了明顯的腐敗味，色澤變?yōu)樯罴t色，有較多汁液流失，肉的表面出現(xiàn)粘手現(xiàn)象，肌肉彈性徹底消失，食用品質(zhì)降至最低。

表2 羊肉儲藏過程中的感官評定結(jié)果Table 2 Sensory evaluation results during mutton storage

肉的pH值不僅對嫩度、保水性等品質(zhì)有較大影響，還在一定程度上影響著肌肉內(nèi)源酶活性，從而影響蛋白的降解，最終對肉的腐敗進程產(chǎn)生影響，是指示肉品新鮮度的重要指標[21-22]。如圖3a所示，樣品的初始pH值為5.68，分析原因是羊肉此時已進入糖酵解階段，產(chǎn)生了較多乳酸，進而導致pH值偏低[23]。隨后，羊肉的pH值逐漸上升，這可能是由于肌肉氧氣供應(yīng)不足，肌質(zhì)網(wǎng)被破壞，大量流失的Ca2+激活了鈣蛋白酶體系，促進了肌原纖維蛋白降解為小分子多肽，部分多肽繼續(xù)降解為游離氨基酸，這些游離氨基酸和肽類物質(zhì)又被微生物利用進而生成胺類物質(zhì)，最終使pH值升高[24-26]。

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）包括氨及胺類物質(zhì)，是肉在儲藏過程中，蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸等含氮化合物被內(nèi)源酶及細菌分解，產(chǎn)生的揮發(fā)性堿性物質(zhì)，如氨、三甲胺、二甲胺、尸胺和腐胺等物質(zhì)的統(tǒng)稱[27-28]。肉類的TVB-N值小于15 mg/100 g為新鮮肉，15～20 mg/100 g為次鮮肉，大于20 mg/100 g為腐敗肉[29]。由3b可知，羊肉初始TVB-N值為7.6 mg/100 g，儲藏24 h后為11.6 mg/100 g，此時羊肉處于新鮮級別；儲藏48 h時，TVB-N值升至18.8 mg/100 g，此時羊肉已降至次新鮮級；當儲藏72 h時羊肉的TVB-N值已增至32.9 mg/100 g，遠高于腐敗閾值，已經(jīng)腐敗變質(zhì)。

微生物是導致肉腐敗的主要原因，冷鮮肉新鮮度的評定標準為：一級鮮度：小于等于5 lgCFU/g，次級鮮度：5～7 lgCFU/g，腐?。捍笥诘扔? lg CFU/g[30]。由圖3c可知，羊肉儲藏前的菌落總數(shù)為2.1 lgCFU/g，此時羊肉處于新鮮階段。隨著儲藏時間的增加，菌落總數(shù)在24 h時大幅度增加，羊肉達到次新鮮程度。隨著微生物的迅速生長繁殖，在儲藏48 h時菌落總數(shù)增至7.6 lg CFU/g，高于腐敗臨界值，羊肉失去食用價值。

酸度/氧化力系數(shù)是肉pH值與氧化力的比值，是羊肉新鮮度的另一指示指標[15]。由圖3d可知，羊肉在儲藏過程中酸度/氧化力系數(shù)值呈現(xiàn)下降趨勢（P＜0.05）。原因是羊肉在儲藏期間蛋白質(zhì)在微生物的作用下被分解產(chǎn)生胺類物質(zhì)，導致肉的酸度下降，致使酸度/氧化力值整體呈下降趨勢，這與pH值結(jié)果規(guī)律一致[31]。另一主要原因是隨著羊肉微生物的大量繁殖和生長，導致氧化力增加，致使酸度/氧化力系數(shù)顯著降低（P＜0.05）[32]。

綜上所述，羊肉在儲藏過程中，pH值逐漸升高，酸度/氧化力系數(shù)逐漸下降，菌落總數(shù)在儲藏48 h時達到腐敗閾值；感官評定與TVB-N則在羊肉儲藏72 h時，指示肉已腐敗變質(zhì)。綜合以上指標，對羊肉進行新鮮度分級，即儲藏時間t＜24 h（新鮮），24 h＜t＜48 h（次新鮮），t＞72 h（腐?。?。

2.3.2 納米纖維膜的色差

為探究納米纖維智能標簽對羊肉新鮮度的監(jiān)測可行性，以TVB-N作為劃分羊肉新鮮度的主要指標，分析標簽顏色變化與TVB-N的關(guān)系，結(jié)果如圖4所示。羊肉在儲藏過程中，隨著腐敗程度的增加，在內(nèi)源性酶和微生物作用下，生成了揮發(fā)性生物胺，如氨、三甲胺、尸胺、腐胺等，這些堿性物質(zhì)揮發(fā)后導致環(huán)境pH值增加，花青素中的黃酮離子發(fā)生水合作用形成了無色的查爾酮結(jié)構(gòu)，致使納米纖維膜產(chǎn)生顏色變化[33-34]。新鮮羊肉的TVB-N值約為7.2 mg/100 g，儲存1 d后TVB-N微增至11.6 mg/100 g，同時納米纖維膜顏色從紅粉色變?yōu)闇\粉色，ΔE（色差值）為4.9，已能被肉眼所識別[35]。當羊肉儲存3 d時，TVB-N值增至32.97 mg/100 g，表明肉已變質(zhì)腐敗，同時包裝盒中的納米纖維膜從淡粉色變?yōu)榘咨?，ΔE增至13.6，這可以讓一個非專業(yè)人士裸眼識別。但根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，到羊肉儲藏3d時，ΔE誤差較大，同時觀察到標簽顏色在組間差異比較大，個別樣品依舊呈淡粉色，未變成白色。分析原因是，羊肉的初始微生物污染菌株存在差異，導致其產(chǎn)生的揮發(fā)性生物胺不同，進而與花青素的反應(yīng)不同，最終導致標簽最后呈現(xiàn)的顏色不同?？偠灾?，納米纖維智能標簽顏色變化與肉的新鮮度指示指標TVB-N大致呈現(xiàn)一致的規(guī)律，可以依據(jù)標簽顏色對羊肉新鮮度進行初步無損檢測。

2.4 智能標簽監(jiān)測羊肉新鮮度的預(yù)測模型及市場應(yīng)用

2.4.1 新鮮度指標與標簽色差的相關(guān)性分析

為分析新鮮度指標與纖維膜ΔE的關(guān)系，進行了相關(guān)性分析。由表3可知，納米纖維膜ΔE與感官評分呈極顯著負相關(guān)（P＜0.001）、與酸度/氧化力系數(shù)呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）；ΔE與TVB-N、菌落總數(shù)和pH值均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.001）。由此可知，ΔE與各指標呈較高的相關(guān)性，可以作為肉類新鮮度的評定指標。

表3 羊肉在儲藏期間各指標的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of various indexes of mutton during storage

2.4.2 預(yù)測方程的建立

將感官評分、TVB-N、菌落總數(shù)、pH值和酸度/氧化力系數(shù)作為因變量，將EΔ 作為自變量進行模擬。使用JMP軟件中的標準二乘法，ΔE的宏選項選用響應(yīng)面進項。利用JMP軟件進行方程模擬，由表4可以看出，經(jīng)過模擬，每個指標均被成功模擬出方程，且調(diào)整后的決定系數(shù)R2均在0.9以上，且極為顯著，這表明模型已成功建立。由于TVB-N值有國標劃分新鮮度的標準，所以選用TVB-N模型作為羊肉新鮮度的預(yù)測模型。預(yù)測模型如下

表4 模型匯總Table 4 Model summary

2.4.3 市場應(yīng)用及模型驗證

將納米纖維膜制成符合市場要求的智能標簽，根據(jù)上述TVB-N模型方程對標簽指示肉品新鮮度的剩余貨架期進行預(yù)測，并應(yīng)用于市場中做進一步驗證。試驗樣本選取市售的內(nèi)蒙古蘇尼特羊后腿肉，包裝方式為托盤包裝，儲藏溫度與建立模型的溫度一致（（10±2） ℃）。由圖 5可知，納米纖維智能標簽可對羊肉新鮮度進行初步可視化監(jiān)測，消費者能通過標簽明顯的顏色變化裸眼識別肉品新鮮度。智能標簽的價格估算如表5所示，一個標簽總價格約為0.002 7元。為驗證標簽檢測的準確性，JMP軟件自動比對了羊肉真實TVB-N值與預(yù)測TVB-N值，結(jié)果如圖6所示，發(fā)現(xiàn)二者呈正相關(guān)，且誤差較小，預(yù)測準確度達88.2%。綜上所述，智能標簽價格低廉、方便快捷、操作簡便，在肉類的無損、實時及可視化檢測領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用前景，可實現(xiàn)肉類在生產(chǎn)、流通和銷售過程中的新鮮度檢測。

表5 納米纖維膜的價格估評Table 5 Price evaluation of nanofiber membrane (1 cm×2 cm)

3 結(jié) 論

1）花青素納米纖維智能標簽由直徑約為250 nm的纖維絲構(gòu)成，表面呈淡粉色，具有較好的胺響應(yīng)性，智能標簽在533 nm的紫外吸光度與氨濃度呈反比關(guān)系R2=0.989 7。

2）智能標簽可初步應(yīng)用于羊肉新鮮度的實時及可視化檢測中，其顏色變化與TVB-N大致呈現(xiàn)一致的規(guī)律。

3）標簽顏色變化與各新鮮度指標有明確的線性關(guān)系，R2均大于0.9，根據(jù)色差值ΔE可預(yù)測羊肉新鮮度以及剩余貨架期，準確率可達到88.2%，同時該標簽價格低廉，只需0.002 7元，為今后實現(xiàn)肉類新鮮度實時、無損和可視化檢測提供了新的方向與選擇。