香露兜中2-乙酰-1-吡咯啉的鑒定與定量分析

陳思平 ，郭培培, ，秦曉威，宗迎，黃艷麗 *，夏志強(qiáng)

1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院（普洱 665000）；2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所/農(nóng)業(yè)部香辛飲料作物遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（萬寧 571533）；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院（成都 611130）；4.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所（海口 571101）

香露兜（Pandanus amaryllifoliusRoxb.），為露兜樹科（Pandanaceae）露兜樹屬（Pandanus）多年生熱帶園藝作物，因其葉加于米中蒸食可產(chǎn)生香稻的“粽香”而聞名[1-2]，是熱帶、亞熱帶地區(qū)廣泛使用的一種天然食用調(diào)味料。其富含生物堿、多酚、黃酮等活性物質(zhì)，具有抑制氧化酶活性、降血糖和改善代謝等作用[3-9]。香露兜原產(chǎn)于印度尼西亞馬魯古群島，我國于20世紀(jì)50年代由歸國華僑引進(jìn)并試種成功，目前主要栽培于海南、云南等省區(qū)[2]，現(xiàn)已成為海南當(dāng)?shù)氐南M(fèi)新潮和休閑旅游的特色品牌之一。作為一種深受人們喜愛的天然食用增香料，香露兜長期存在需求旺盛與供應(yīng)不足的問題，因而具有重要的潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)前景，對提高邊遠(yuǎn)地區(qū)農(nóng)民收入和生活水平具有重要意義。

2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）又名古嗎啉，為淡黃色液體，有增進(jìn)食欲和改善新陳代謝的作用[3]，是香稻的主要香氣貢獻(xiàn)物，也是香露兜產(chǎn)生“粽香”的特征致香成分[4,19]。相關(guān)研究表明，香露兜中2-AP的含量是香稻中的10倍多[14,20]，高2-AP含量正是其商業(yè)價(jià)值所在。2-AP的提取有水蒸氣蒸餾法[10]、有機(jī)溶劑萃取法[11-12]、超臨界CO2萃取法[13-14]等，但鮮有對多種提取方法進(jìn)行比較的報(bào)道。國內(nèi)外采用氣相色譜（GC）技術(shù)[16]、氣相色譜-氫火焰離子化檢測器（GC-FID）技術(shù)[14-15]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）技術(shù)[10,13,17]、高效液相色譜（HPLC）技術(shù)[18]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）技術(shù)[19]等對2-AP的定性和定量分析開展了廣泛的研究，能夠較好地滿足2-AP的檢測要求，但多集中在香稻的研究上，對香露兜中2-AP的分析研究相對較少。而且，隨著大型分析儀器的普及，超高效液相色譜（UPLC）技術(shù)在定量分析方面具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確度，不需要對樣品進(jìn)行富集即可檢測，與GC、HPLC等相比更加快速高效。為對香露兜中的特征香氣成分2-AP進(jìn)行鑒定和定量分析，此次試驗(yàn)以海南引種栽培的香露兜為材料，比較分析乙醇溶劑（75%和100%兩種不同比例）的3種不同提取方法（蒸餾法、浸提法和超聲波輔助法）對香露兜中2-AP提取效率的影響，利用GC-MS技術(shù)結(jié)合保留指數(shù)對樣品中2-AP進(jìn)行鑒定，并在此基礎(chǔ)上采用靈敏度更高的UPLC技術(shù)對2-AP含量進(jìn)行更加準(zhǔn)確的定量分析，旨在為2-AP檢測標(biāo)準(zhǔn)的編訂、香露兜的資源評價(jià)和香露兜產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Aglient-7890/5977B GC-MS聯(lián)用儀、Agilent 1290超高效液相色譜儀配備DAD檢測器（美國安捷倫公司）；Pall-cascada純水/超純水一體化機(jī)系統(tǒng)（美國頗爾公司）；電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）；S6000超聲波清洗機(jī)（東莞市墨潔超聲波設(shè)備公司）。

2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）標(biāo)準(zhǔn)品（≥98.0%，上海源葉生物科技有限公司）；C7～C30正構(gòu)烷烴混標(biāo)準(zhǔn)品（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司）；75%乙醇、100%乙醇（分析純，山東利爾康醫(yī)療公司）；乙醇、甲醇（色譜醇，西隴科學(xué)公司）；水（娃哈哈純凈水）。

供試樣品香露兜采自海南興隆熱帶植物園，經(jīng)秦曉威副研究員鑒定為露兜樹科露兜樹屬植物香露兜Pandanus amaryllifoliusRoxb.。

1.2 方法

1.2.1 香露兜中2-AP的提取

選取成熟、無病蟲害和無機(jī)械損傷的香露兜新鮮葉片，清洗晾干，切碎并混勻，備用。分別采用蒸餾法、浸提法、超聲波輔助法進(jìn)行提取，每種方法又采用75%和100%兩種不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇分別作萃取溶劑。每種提取方式均重復(fù)3次。

蒸餾法：精密稱取40 g樣品于圓底燒瓶中，加入500 mL乙醇溶劑，保持微沸狀態(tài)蒸餾提取4 h，收集餾出液，除水，待測。

浸提法：精密稱取40 g取樣品于錐形瓶中，加入500 mL乙醇溶劑，常溫下浸提4 d，過濾，除水，待測。

超聲波輔助提取法：精密稱取40 g樣品于錐形瓶中，加入500 mL乙醇溶劑，在50 ℃下超聲波輔助提取40 min，過濾，除水，待測。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取15.35 mg 2-AP標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL容量瓶中，用UPLC級乙醇溶劑溶解，定容，得質(zhì)量濃度為1.535 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，于-18 ℃避光貯存。準(zhǔn)確移取適量上述標(biāo)準(zhǔn)貯備液，稀釋成500，300，150，100，50和30 μg/mL梯度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.3 UPLC樣品供試液的制備

準(zhǔn)確稱取5.00 g 1.2.1小節(jié)中香露兜樣品于20 mL容量瓶中，加入U(xiǎn)PLC級乙醇溶劑，定容至刻度線。在50 ℃下超聲波輔助提取40 min，過濾，提取液加入無水硫酸鈉除水，經(jīng)0.22 μm有機(jī)膜過濾，按1.2.4條件上機(jī)測定。

1.2.4 GC-MS和UPLC儀器分析條件

GC分析條件：DB-WAX毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣位高純度He2（99.999%）；流速1 mL/min，不分流；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始溫度50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升溫至100 ℃，再以6 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min；進(jìn)樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：離子源電離方式EI；電子能量70 eV；MS四極桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃；掃描質(zhì)量范圍m/z30～450。

UPLC分析條件：色譜柱Zorbax Eclipse Plus-C18（4.6 mm×250 mm，5 Micron）；流動(dòng)相為甲醇-水9∶1，流速0.5 mL/min；檢測波長206 nm；進(jìn)樣量5 μL；左右柱溫箱25 ℃。

1.2.5 保留指數(shù)（IT）的計(jì)算

式中：z和z+1分別為目標(biāo)化合物（2-AP）流出前后的正構(gòu)烷所含碳原子的數(shù)目；TR(2-AP)，TR(z)和TR(z+1)分別代表2-AP及碳原子數(shù)為z和z+1正構(gòu)烷的保留溫度，且TR(z)＜TR(2-AP)＜TR(z+1)。

2 結(jié)果與討論

2.1 香露兜中2-AP提取方法的優(yōu)化

如圖1所示，比較乙醇溶劑（75%和100%兩種不同比例）的3種提取方法（蒸餾法、浸提法和超聲波輔助法）共6種不同提取方式對香露兜中2-AP提取效率的影響，GC檢出的2-AP峰面積存在顯著性差異（p＜0.05）。其中，超聲波輔助100%乙醇溶劑提取法檢出的2-AP峰面積最大。

乙醇溶劑對2-AP溶解度比丙醇、甲醇高[12]，且安全、毒性低。香露兜中2-AP的提取法較多采用水蒸氣蒸餾法[10]和有機(jī)溶劑萃取法[11-12,20]。超聲波輔助提取法利用超聲波破壞植物細(xì)胞組織，加大了溶劑的滲透作用，提取效率較高，比蒸餾法減少了熱降解、熱揮發(fā)的損失，比浸提法提取得更充分。故采用超聲波輔助100%乙醇萃取法提取香露兜中的2-AP，以獲得較高的提取效率。

圖1 2-AP不同提取方式下氣相色譜峰面積圖

2.2 香露兜中2-AP的GC-MS鑒定

如圖2所示，在1.2.4項(xiàng)檢測條件下，2-AP標(biāo)準(zhǔn)品和樣品質(zhì)譜掃描均得到較豐富的離子碎片信息，離子碎片特征質(zhì)荷比均在同一位置出現(xiàn)，其特征離子峰質(zhì)荷比為m/z111，83，68，69，55，52，42，43和41，分子離子峰為m/z111。2-AP樣品質(zhì)譜信息與標(biāo)準(zhǔn)品匹配度達(dá)90.4%。

如圖3所示，在1.2.4項(xiàng)檢測條件下，目標(biāo)化合物2-AP色譜峰分離度良好，2-AP標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間t標(biāo)=（12.324±0.18）min，樣品中2-AP保留時(shí)間t樣=（12.529± 0.24）min。由1.2.5項(xiàng)保留指數(shù)公式計(jì)算得2-AP的實(shí)際保留指數(shù)1 331±2，參考保留指數(shù)為1 330±7。2-AP的實(shí)際保留指數(shù)在參考保留指數(shù)范圍內(nèi)。

GC-MS可對某個(gè)特定成分進(jìn)行鑒定和定量分析[17-19]。GC-MS在鑒定香露兜特征香氣成分2-AP的同時(shí)，還可檢測出香露兜中角鯊烯、葉綠醇等其他香氣成分[12-14]；而在定量分析上，UPLC比GC靈敏度高，更加快速高效。因此，確定分別采用GC-MS和UPLC對香露兜中2-AP進(jìn)行鑒定和定量分析。

圖2 2-AP標(biāo)準(zhǔn)品MS譜圖（A）和樣品MS譜圖（B）

圖3 2-AP標(biāo)準(zhǔn)品GC譜圖（A）和樣品GC譜圖（B）

2.3 2-AP的UPLC定量分析

2.3.1 檢測波長的選擇

2-AP標(biāo)準(zhǔn)品在UPLC檢測器DAD下光譜全掃描，結(jié)果如圖4所示。2-AP在206 nm波長處有最大吸收峰，且干擾較少。確定選擇λ=206 nm作為2-AP定量分析波長。

圖4 2-AP全波長掃描圖

2.3.2 2-AP的UPLC色譜圖

在λ=206 nm處，2-AP標(biāo)準(zhǔn)品和樣品按1.2.4項(xiàng)儀器工作條件進(jìn)樣檢測，結(jié)果如圖5所示。2-AP標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間t標(biāo)=5.345 min，樣品保留時(shí)間t樣=5.316 min。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間一致。

圖5 2-AP標(biāo)準(zhǔn)品UPLC色譜圖（A）和樣品UPLC色譜圖（B）

2.3.3 線性范圍、檢出限和定量限

1.2.2 項(xiàng)系列標(biāo)準(zhǔn)液在1.2.4項(xiàng)檢測條件下進(jìn)樣分析，以色譜峰面積x為橫坐標(biāo)，濃度y為縱坐標(biāo)，繪制2-AP標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程y=0.351 2x+5.018 8，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 5。結(jié)果表明，2-AP在30～500 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

以信噪比S/N≥3和S/N≥10分別計(jì)算檢出限（LOD）和定量限（LOQ），測得LOD為0.005 14 mg/mL，LOQ為0.017 1 mg/mL。

2.3.4 精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)

取2-AP標(biāo)準(zhǔn)品和1.2.3項(xiàng)樣品供試液，各1份，按1.2.4項(xiàng)儀器工作條件，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行精密度試驗(yàn)。記錄2-AP峰面積，計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)品δRSD為1.35%，樣品δRSD為1.43%。

取2-AP標(biāo)準(zhǔn)品和1.2.3項(xiàng)樣品供試液，各1份，按1.2.4項(xiàng)儀器工作條件，1 d內(nèi)分別在0，2，4，8，12和24 h進(jìn)樣，進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。記錄2-AP峰面積，計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)品δRSD為0.98%，樣品δRSD為1.80%。

取2-AP標(biāo)準(zhǔn)品和1.2.3項(xiàng)樣品供試液平行樣，各6份，按1.2.4項(xiàng)儀器工作條件進(jìn)樣檢測，進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。記錄2-AP峰面積，計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)品δRSD為1.08%，樣品δRSD為1.54%。

精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)中，δRSD＜2%，均在可接受標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)。

2.3.5 樣品加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

取9份已知2-AP含量的樣品供試液，分成3組（每組3份），分別按80%，100%和120%水平加入2-AP標(biāo)準(zhǔn)液，按照1.2.4項(xiàng)儀器工作條件進(jìn)樣檢測，以外標(biāo)法計(jì)算2-AP含量，結(jié)果如表1所示。樣品加標(biāo)回收率在92.6%～98.6%之間，3個(gè)水平δRSD分別為3.23%，2.35%和0.95%。該方法滿足GB/T 27404—2008附錄F[21]的要求，可用于香露兜中2-AP的定量分析。

表1 方法回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=9）

2.4 實(shí)際樣品的分析

表2 香露兜樣品中2-AP的含量（n=6）

按1.2.3項(xiàng)制備6份樣品供試液平行樣，按1.2.4項(xiàng)儀器工作條件進(jìn)樣，UPLC測定結(jié)果如表2所示。根據(jù)1.2.3項(xiàng)樣品供試液制備工藝，計(jì)算得香露兜中2-AP含量為637.8 mg/kg。香露兜成熟鮮葉中富含2-乙酰-1-吡咯啉。

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)建立了超聲波輔助100%乙醇提取、氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）鑒定、超高效液相色譜（UPLC）定量分析香露兜中特征香氣成分2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）的檢測方法。采用該方法測得香露兜成熟鮮葉中2-AP含量高達(dá)637.8 mg/kg。該方法準(zhǔn)確度高，靈敏度、可靠性等均符合理化檢測檢驗(yàn)方法確認(rèn)的技術(shù)要求，適用于香露兜中2-AP的鑒定和定量分析，為2-AP相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)的編訂提供了技術(shù)支持，也為香露兜的資源評價(jià)、產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。