UPLC-MS/MS法快速測定嬰幼兒配方奶粉中的L-肉堿

劉玲君，何香婷，翟紅梅，房新平*，白素琴

1.河北三元食品有限公司，河北省母嬰特膳及乳制品技術(shù)創(chuàng)新中心（石家莊 050000）；2.北京三元食品股份有限公司，白素琴首席技師工作室（北京 100163）

L-肉堿（L-carnitine），化學(xué)名為3-羧基-4-N-三甲基-氨基丁酸（3-hydroxy-4-N-trimethyla minobutyrate），是一種在人體中廣泛存在的類氨基酸，主要分布在肌肉、心臟中，其主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪進(jìn)入線粒體，促進(jìn)脂肪酸燃燒，為機(jī)體提供能量[1-3]，人體不僅可通過食物獲取L-肉堿，且在體內(nèi)可自行合成[4]，但嬰幼兒自身合成能力較低，因此必須在嬰幼兒食品中補(bǔ)充。

GB 10765—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰兒配方食品》規(guī)定，L-肉堿為可選擇性加入成分，規(guī)定最小添加量為0.3 mg/100 kJ[5]。嬰幼兒配方奶粉中L-肉堿的檢測可采用GB 29989—2013[6]分光光度計(jì)法，但由于顯色液配制復(fù)雜，乙酰輔酶A和乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶不穩(wěn)定，使檢測結(jié)果重復(fù)性差，且檢出限較高，為0.6 mg/100 g。文獻(xiàn)報(bào)道的L-肉堿檢測方法主要有酶顯色法[7-9]、離子色譜法[10-11]、高效液相色譜法[12-14]等。

建立UPLC-MS/MS法快速測定嬰幼兒奶粉中L-肉堿含量，該方法分析速度快，操作步驟簡單，避免復(fù)雜步驟造成的目標(biāo)物的損失，靈敏度高，重復(fù)性好，適用于企業(yè)大批量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰配奶粉（質(zhì)控樣品）。

左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品（CAS 541-15-1，純度＞98%，Sigma公司）；濃鹽酸（分析純，利安隆博華天津醫(yī)藥化學(xué)有限公司）；氫氧化鈉（分析純，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司）；冰乙酸（優(yōu)級(jí)純，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司）；甲酸（色譜純，Dikma公司）；乙腈、甲醇（均為色譜純，F(xiàn)isher chemical公司）；試驗(yàn)用超純水（Millipore Milli-Q系統(tǒng)凈化蒸餾水獲得）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290 LC/6420 MS液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源，美國安捷倫公司）；KQ3200 DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；PB-10 pH計(jì)（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；AL 204-IC電子天平、XS 2050U電子分析天平（特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為CORTECS HILIC（3.0 mm×100 mm，2.7 μm），柱溫25 ℃，進(jìn)樣量2 μL，流速0.3 mL/min，以甲醇-0.1%甲酸（體積比20∶80）為流動(dòng)相。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源采用電噴霧（ESI）離子源；正離子掃描模式；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細(xì)管電壓4 kV；霧化氣和碰撞氣采用高純氮；干燥氣流速10 L/min，干燥氣溫度350 ℃，質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 L-肉堿的質(zhì)譜分析參數(shù)

1.4 樣品的前處理

準(zhǔn)確稱取1.00 g（精確到0.1 mg）混合均勻的樣品于100 mL三角瓶中，加入10 mL 0.1 mol/L鹽酸和30 mL水，超聲提取15 min，用4%氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 4.5，定容至100 mL，過濾，濾液過0.22 μm濾膜，上機(jī)進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜分析測定。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：稱取1.00 g（精確到0.1 mg）L-肉堿于100 mL容量瓶中，用超純水溶解定容、混勻，得到質(zhì)量濃度10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制：取奶粉空白試樣，按照1.4小節(jié)的前處理方法得到的濾液作為溶劑，配制系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，將L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得到質(zhì)量濃度10，50，100，200，500和1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

肉堿是一種小分子強(qiáng)極性化合物，沒有特殊的紫外吸收，先前的研究都是通過衍生化反應(yīng)來減少L-肉堿的極性，使其帶有生色團(tuán)的同時(shí)更適合于在反相條件的保留，試驗(yàn)不需衍生，分別對(duì)比C18柱、C4柱和HILIC柱的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)C18柱和C4柱基本在死時(shí)間出峰，且拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，而HILIC柱保留時(shí)間適中，峰形很好，見圖1，適合定量分析。

圖1 HILIC柱對(duì)L-肉堿的多反應(yīng)檢測色譜圖

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

L-肉堿分子結(jié)構(gòu)中含有季銨堿性基團(tuán)，適合用電噴霧離子源，正離子檢測方式，L-肉堿的準(zhǔn)分子離子[M+H]+質(zhì)核比為m/z162.2，選擇其作為母離子并進(jìn)行下一步碰撞誘導(dǎo)解離，對(duì)碰撞能量、碎裂電壓、干燥氣流速、溫度進(jìn)行優(yōu)化。二級(jí)質(zhì)譜顯示信號(hào)最強(qiáng)烈的碎片離子質(zhì)核比為m/z103.1，85.2和60.3。由圖2可知，信號(hào)最高的m/z103.1碎片離子可作為定量離子，其次是m/z60.3作為定性離子，最終質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。在檢測過程中，采用切換法，將L-肉堿出峰前和出峰后的色譜柱流出液導(dǎo)入廢液通道，避免因離子源污染而導(dǎo)致信號(hào)抑制，減小信噪比，提高儀器的準(zhǔn)確度和靈敏度。

圖2 L-肉堿的ESI/MS/MS質(zhì)譜圖

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

對(duì)于奶粉中L-肉堿的檢測，既要保證樣品的均一性，又要減少樣品基質(zhì)中常量目標(biāo)化合物對(duì)儀器的污染。從原始固體樣品中取出部分代表性樣品，充分混合，用四分法縮分，準(zhǔn)確稱取樣品，加入鹽酸溶液進(jìn)行超聲提取。

試驗(yàn)對(duì)超聲時(shí)間和最終調(diào)節(jié)的pH進(jìn)行優(yōu)化。

2.3.1 超聲時(shí)間的優(yōu)化

分別稱取5份同一份樣品，加入鹽酸溶液后，分別超聲5，10，15，20和25 min，進(jìn)行檢測，提取結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，超聲提取時(shí)間越長，提取效果越好，但15 min后基本無變化，所以最終選擇超聲提取15 min。

圖3 不同超聲提取時(shí)間所得到L-肉堿含量

2.3.2 最終pH的選擇

用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH梯度（pH 3.5，3.8，4.0，4.5，5.0和7.0），分別上機(jī)檢測L-肉堿含量，結(jié)果顯示只有在pH 4.5時(shí)，蛋白沉淀完全，濾液澄清，且在LC/MS/MS中色譜峰形最佳。

2.3.3 稀釋倍數(shù)的選擇

由于LC/MS/MS儀器靈敏度高，必須使樣品進(jìn)行一定倍數(shù)稀釋才能使處理液中L-肉堿含量在儀器的最佳線性范圍內(nèi)。稀釋還可使樣品基質(zhì)的抑制減小，使儀器的信噪比降低，提高靈敏度。最終選擇在處理液定容100 mL之后，過0.22 μm濾膜，用超純水稀釋5倍。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 線性范圍和檢出限

用超純水配制L-肉堿濃度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行LC/MS/MS測定，以各組分響應(yīng)值（Y）和相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度（X）作標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)表明，L-肉堿在10～1 000 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.999 3?？梢詽M足定量分析的需要，結(jié)果計(jì)算采用外標(biāo)法定量。

取儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣量2 μL。以信噪比S/N=3計(jì)算L-肉堿的檢出限（LOD）和S/N=10計(jì)算定量限（LOQ）分別為0.000 1和0.001 mg/kg，能夠滿足實(shí)際樣品分析對(duì)檢測限的要求。

2.4.2 回收率和精密度

表2 L-肉堿的回收率和精密度（n=5）

分別取2個(gè)嬰配基質(zhì)奶粉樣品和2個(gè)購買的質(zhì)控樣品，按試驗(yàn)方法測定其中的L-肉堿本底含量。另向奶粉樣品中分別加入80，160和320 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控樣品中分別加入50，100和200 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)品，每個(gè)樣品平行測定5次，計(jì)算其加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表2。質(zhì)控樣品檢測結(jié)果，與真值99 mg/kg滿足誤差范圍。L-肉堿加標(biāo)回收率為82.43%～96.91%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.46%～5.65%。方法顯示較好的回收率及重復(fù)性，能夠滿足實(shí)際樣品的分析要求。

2.4.3 方法重現(xiàn)性

通過同一儀器、同一實(shí)驗(yàn)員、同一天對(duì)同一質(zhì)控樣品按試驗(yàn)方法進(jìn)行連續(xù)檢測3 d，每天重復(fù)測定（n=5），考察方法的重現(xiàn)性。結(jié)果顯示，方法的日內(nèi)精密度為2.6%、日間精密度為5.7%，表明方法重現(xiàn)性良好。

3 結(jié)論

試驗(yàn)方法基于酸水解超聲提取的高效快速，高效液相色譜-質(zhì)譜法的高分離能力和高靈敏度，通過對(duì)樣品前處理和液相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化，建立一種適用于嬰幼兒奶粉復(fù)雜基質(zhì)的L-肉堿的快速檢測技術(shù)。方法采用CORTECS HILIC色譜柱進(jìn)行分離，以甲醇-0.1%甲酸為流動(dòng)相，流速0.3 mL/min，在優(yōu)化條件下，樣品在5 min內(nèi)完成分析，分析速度快，L-肉堿在10～1 000 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限低。該方法操作簡便、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于大量嬰幼兒配方奶粉樣品中的L-肉堿的快速測定。