響應(yīng)面法優(yōu)化刺梨精釀啤酒釀造工藝

李巖，姜鑫，黃劍，董小雷，劉同軍*，宋揚*

1.齊魯工業(yè)大學(xué)（山東省科學(xué)院）（濟南 250306）；2.泰山市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局（泰安 271000）

我國是啤酒消費大國，精釀啤酒品種多樣，越來越受到人們的喜愛[1]。艾爾啤酒是精釀啤酒的主要種類，是使用上面發(fā)酵酵母發(fā)酵，與拉格啤酒相比具有發(fā)酵速度快、酯香濃郁、口感醇厚等特點[2]。刺梨具有很高的營養(yǎng)價值，富含維生素C、胡蘿卜素、葉酸、氨基酸等，其中維生素C含量有“果中之王”之稱[3-4]；刺梨還具有抗氧化、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤和防治糖尿病等多種藥理作用[5]；金刺梨中含有的萜類化合物對多種有害菌起到抑制作用，可作為天然的食品防腐劑使用[6-7]。姚敏等[8]研究發(fā)現(xiàn)刺梨在發(fā)酵后VC、多酚和黃酮的保留率很高；王若琳[9]研究發(fā)現(xiàn)刺梨的香氣中酸香、果香、木香、青香是關(guān)鍵香韻；彭邦遠[10]研究發(fā)現(xiàn)對刺梨酒香味貢獻最大的是酯類和烯烴類；劉曉柱等[11]研究發(fā)現(xiàn)在刺梨酒制備過程中非釀酒酵母會產(chǎn)生甘油和酯類等物質(zhì)，分泌的胞外酶會水解結(jié)合態(tài)底物，豐富刺梨汁的香味。王瑜等[12]研究發(fā)現(xiàn)，刺梨汁在發(fā)酵期添加可促進果實中多酚等物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和有機酸、醇類和酯類物質(zhì)含量增加，這些物質(zhì)成分可以增加啤酒中刺梨的風(fēng)味感和層次感。刺梨在啤酒中的應(yīng)用鮮有報道，近年來隨著消費升級，啤酒的中高端領(lǐng)域一直是中國品牌的軟肋[13]，刺梨啤酒的研究可以豐富精釀市場的多樣化。

1 材料與方法

1.1 材料

皮爾森麥芽（3.3EBC）、慕尼黑麥芽（17.7EBC）、焦香麥芽（59.1EBC）：永順泰（昌樂）麥芽有限公司；酒花Amarillo（亞麻黃）：張掖斯丹納酒花有限公司；酵母US-05：Fermentis公司；刺梨：貴州龍里新鮮刺梨，充分成熟。

1.2 儀器與設(shè)備

SPL-250恒溫箱，濟南龍瑞商貿(mào)有限公司；SWCJ-2D超凈臺，蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；SD9012B EBC色度計，上海昕瑞儀器儀表有限公司；WYT-J手持糖度計，上海壘固儀器有限公司；YXQLS-75SII滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。50 L啤酒家釀設(shè)備，申東設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 成品啤酒理化指標分析

雙乙酰、苦味值、總酸和酒精度的測定：參考GB/T 4928—2008。

1.3.2 啤酒釀造過程及工藝要點

麥芽粉碎：78.6%皮爾森麥芽（3.3EBC）、4.9%慕尼黑麥芽（17.7EBC）、16.5%焦香麥芽（59.1EBC）混合，加水濕粉碎，粉碎原則破而不碎[14]。

刺梨汁制備：將刺梨果經(jīng)去蒂、清洗、破碎后于榨汁機中按1∶1加水榨汁，所得原刺梨果汁加SO2至80 mg/L，經(jīng)4 ℃過夜冷儲，去除沉淀物后備用，操作期間盡量避免果汁與空氣長時間接觸。

糖化工藝：糖化包括恒溫浸出法一段式糖化、過濾和洗糟。糖化料水比1∶3，邊攪拌邊投料避免結(jié)塊，投料結(jié)束后的醪液溫度為67 ℃，維持60 min；升溫至78 ℃，維持10 min，糖化完成。過濾前添加78 ℃的洗糟水至剛好沒過過濾篩板，糖化醪液轉(zhuǎn)移至過濾槽，麥汁在過濾槽中靜置20 min，回流后過濾，控制麥汁流出速度保證麥汁清亮，無渾濁產(chǎn)生。洗糟兩次，水溫控制在76～78 ℃。

麥汁煮沸工藝：麥汁煮沸時間共60 min，初沸5 min時添加30% Amarillo；煮沸20 min時添加35% Amarillo；煮沸終了前10 min添加35% Amarillo。煮沸結(jié)束后麥汁快速回旋，靜置20 min分離熱凝固物。

發(fā)酵工藝：煮沸后的麥汁用冷卻盤管降溫至20 ℃左右后把麥汁分裝到1.5 L的PET瓶中，向瓶中加入刺梨汁，在滅菌臺中添加酵母US-05，接種量為1.8×107CFU/mL，然后用無菌封口膜封口，保證透氣并防止雜菌進入，操作期間避免染菌。

后貯：當(dāng)麥汁的殘?zhí)墙档?.0～6.0 °P時封蓋進行后熟，直到雙乙酰的含量＜0.1 mg/L時再用培養(yǎng)箱給麥汁降溫，期間先以1.5 ℃/h降溫至4 ℃并維持24 h，刺梨汁在4 ℃條件下貯藏能更好地釋放其主要的揮發(fā)性物質(zhì)[15]。將發(fā)酵瓶轉(zhuǎn)移至冰箱，以1 ℃/h降溫至0.5 ℃左右，刺梨啤酒在0.5 ℃左右貯酒5～7 d，酒體基本成熟，進行風(fēng)味物質(zhì)的分析。

1.3.3 單因素試驗

采用單因素控制變量法考察原麥汁濃度（10，11，12，13和14 °P）、發(fā)酵溫度（16，18，20，22和24 ℃）和刺梨汁添加量（2%，5%，10%，20%和40%）對刺梨啤酒理化指標及感官評分的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗優(yōu)化釀造工藝

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken方案設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗，確定最優(yōu)方案配比。設(shè)A（原麥汁濃度）、B（發(fā)酵溫度）和C（刺梨汁添加量）為自變量，感官品評分數(shù)為響應(yīng)值（Y），響應(yīng)面分析包括響應(yīng)面二次模型的方差分析及擬合分析，各因素及其水平取值見表1，設(shè)計方案中，每個試驗組都重復(fù)3次，取其均值。試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平

1.3.5 啤酒的感官品評標準

按照少量多次原則，對酒進行重復(fù)的盲測[16]。由8名感官品評專家進行感官品評，對啤酒的泡沫、外觀、香氣（刺梨香，麥芽香及酯香）和口味進行綜合評分，滿分為100分，分數(shù)評分標準見表2。

1.3.6 發(fā)酵罐放大試驗

用最優(yōu)工藝進行50 L發(fā)酵罐放大試驗，以不加刺梨汁作為對照，進行感官品評分析和理化指標分析。對啤酒中描述的3種香味（刺梨果香，麥芽香，酯香）、4種口感特征（酸味，甜味，苦味，澀味）和2種酒體特征（味道持久性，酒體飽滿性）進行打分，分數(shù)范圍為0～5分。

表2 感官評價標準

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗優(yōu)化結(jié)果

由圖1可知，隨著原麥汁濃度的升高，感官品評分先升高后降低，酒精度持續(xù)升高。發(fā)酵醪液中的原麥汁濃度與酵母細胞活力及其發(fā)酵性能有關(guān)，因此原麥汁濃度低時酵母活性不足，發(fā)酵乏力，產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)少，導(dǎo)致感官品評分數(shù)低；隨著原麥汁濃度的升高，酵母活性增強，發(fā)酵產(chǎn)生的香味物質(zhì)更多，酒精度越高，其感官品評分更高[17]；原麥汁濃度過高時不利于突出刺梨的風(fēng)味，而且過高的酒精度會使啤酒過于厚重，因此感官評分降低。由圖1可知，原麥汁濃度12 °P合適，以此為響應(yīng)面中心點。

圖1 原麥汁濃度和對啤酒品質(zhì)的影響

由圖2可知，隨著發(fā)酵溫度的升高，感官品評分先升高后降低；酒精度持續(xù)升高，在發(fā)酵溫度為22 ℃時不再增加。發(fā)酵溫度較低時，酵母發(fā)酵速度緩慢，產(chǎn)生的酯香味淡??；當(dāng)發(fā)酵溫度為高時，酵母代謝能力增強，發(fā)酵速度快，產(chǎn)生副產(chǎn)物高級醇等含量高[18]，產(chǎn)酒精能力增強，對整體口感影響大。由圖2可知，發(fā)酵溫度20 ℃合適，并以此為響應(yīng)面中心點。

圖2 發(fā)酵溫度對啤酒品質(zhì)的影響

由圖3可知，隨著刺梨汁添加量的升高，感官品評分持續(xù)升高，在添加量為20%時才緩慢降低；酒精度持續(xù)降低。刺梨汁添加量直接關(guān)系到刺梨風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生，添加太少刺梨風(fēng)味不明顯，過多則影響啤酒風(fēng)味的協(xié)調(diào)性。刺梨汁添加量關(guān)系到發(fā)酵液中的氨基氮含量，氨基氮的缺乏能夠影響酵母發(fā)酵的速率，酯類和脂肪酸等香味化合物的產(chǎn)生，并且還會產(chǎn)生過多的H2S異味[19-20]，而麥汁中的氨基氮含量最多，發(fā)酵醪液中麥汁的比例少就無法給酵母提供足夠的氨基氮，因此會影響感官評分；酵母活性不夠，產(chǎn)酒精能力明顯下降。由圖3可知，刺梨汁添加量在20%時最合適，以此為響應(yīng)面中心點。

圖3 刺梨汁添加量對啤酒品質(zhì)的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計方案進一步優(yōu)化了原麥汁濃度、發(fā)酵溫度和刺梨汁添加量，所得試驗結(jié)果見表3。

根據(jù)Design-Expert 10軟件設(shè)計方案對試驗數(shù)據(jù)處理，得到多元二次回歸方程模型（感官評分=93.53+0.86A+0.92B-1.82C-0.36AB+0.36AC+1.03BC-2.37A2-3.05B2-4.67C2）并對該模型進行方差分析及擬合分析見表4。

由表4可知，3個因素的影響大小為C＞B＞A；一次項C及二次項A2、B2、C2對感官評分的影響極顯著（p＜0.01）；一次項A、B和交互項BC對結(jié)果影響顯著（p＜0.05）；交互項AB、AC對結(jié)果影響不顯著（p＞0.05）；失擬項為0.050 8＞0.05，表示失擬項不顯著，則該試驗的失擬度好，該模型可以對試驗結(jié)果做出準確的預(yù)測和分析；模型p＜0.000 1，表示該模型極顯著[21]。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果

表4 響應(yīng)面二次模型的方差分析和擬合分析

相關(guān)系數(shù)R2=0.981 5，越接近于1表明相關(guān)性越好，試驗誤差?。唬≧2adj-R2pred）＜0.3，表明這兩個值較接近，此模型適合該工藝過程；CV=0.86%＜ 1%，說明此試驗的精確度和試驗的重復(fù)性高；信噪比為19.705＞4，表明所建立的模型擬合精度好，可用于優(yōu)化原麥汁濃度、發(fā)酵溫度和刺梨汁添加量對感官評分影響的分析[22]。

采用Design-Expert 10軟件根據(jù)回歸方程繪制響應(yīng)面圖及其等高線，見圖4。

圖4 原麥汁濃度、發(fā)酵溫度及刺梨汁添加量的交互作用對感官評分影響的響應(yīng)面和等高線

圖4顯示了每個因素兩兩交互的影響，而其余因素則保持在中心水平。各因素之間的交互作用可以由等高線反映出來，等高線越趨近于橢圓形則兩因素之間交互作用明顯，反之越不明顯[23]。由圖4可知，感官評分隨著發(fā)酵溫度和刺梨添加量的升高先上升后下降，等高線呈橢圓形說明其交互作用顯著，與表4中p值分析結(jié)果一致；響應(yīng)面的斜率較高，表明感官評分對自變量因素的變化較為敏感[24]。

由響應(yīng)面的分析可知，刺梨啤酒最佳發(fā)酵工藝條件為原麥汁濃度12.32 °P、發(fā)酵溫度20.25 ℃和刺梨汁添加量26.28%，在此最優(yōu)條件下，感官評分為90.78分。為了便于實際操作，將工藝條件修訂為原麥汁濃度12 °P、發(fā)酵溫度20 ℃和刺梨汁添加量26%。

2.3 感官分析

用最優(yōu)工藝進行50 L發(fā)酵罐放大試驗，并以不加刺梨汁作為對照，感官品評結(jié)果見圖5。

圖5 感官評價分析

由圖5可知，刺梨啤酒與對照組相比具有明顯的刺梨果香，并且持久性好，麥芽香與果香相輔相成，表現(xiàn)出協(xié)調(diào)的香氣。試驗組澀味和酒體飽滿性較對照組高，可能是因為刺梨果汁含有單寧、多酚及其衍生物，如單寧會給予啤酒澀感，使酒體更加渾厚[8]。試驗組酸味和甜味較平衡，酯香味較對照組差，可能是因為試驗組中麥汁含量多對酵母發(fā)酵更有利，因此產(chǎn)香越多。綜合比較，刺梨啤酒具有更好的表現(xiàn)。

2.4 啤酒理化指標分析

以最優(yōu)工藝進行50 L發(fā)酵罐放大試驗，結(jié)果理化指標見表5。

表5 刺梨啤酒理化指標

對優(yōu)化后的刺梨啤酒進行理化指標分析，結(jié)果表明，酒精度5.4%vol，苦味值15 IBU，色度17.1 EBC，總酸1.74 mL·100 mL-1，雙乙酰0.06 mg·L-1。參考GB/T 4927—2008《啤酒》，其色度、色雙乙酰、酒精度等均符合國家標準。

3 結(jié)論

研究采用單因素試驗和響應(yīng)面法分析對刺梨啤酒釀造工藝條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，刺梨汁添加量對刺梨啤酒品質(zhì)影響最大，釀造工藝的最佳參數(shù)為：原麥汁濃度12 °P，發(fā)酵溫度20 ℃和刺梨汁添加量26%，感官評分為90.78分。以最優(yōu)條件進行放大試驗并進行理化指標的檢測，所釀刺梨啤酒符合GB/T 4927—2008《啤酒》的國家標準，啤酒外觀清亮，泡沫豐富細膩，殺口力強，口感協(xié)調(diào)，有明顯的酒花香和刺梨果香；該研究為刺梨啤酒的發(fā)酵生產(chǎn)可行性提供了理論和實踐基礎(chǔ)，對刺梨的有效利用有重要的指導(dǎo)意義。