斑點(diǎn)叉尾鮰魚下腳料的多肽制備工藝

陳紫紅，林志杰，薛雅茹，洪燕婷，王毅毅，黃茂坤

黎明職業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院（泉州 362000）

斑點(diǎn)叉尾鮰魚（Channel catfish），屬于鯰形目、鮰科魚類[1]。鮰魚的肉質(zhì)鮮美、細(xì)嫩，全身光滑無鱗，營養(yǎng)豐富，含有人體所必需的8種氨基酸、多種維生素以及大量的不飽和脂肪酸[2]。目前國內(nèi)食品企業(yè)主要是進(jìn)行斑點(diǎn)叉尾鮰魚冷凍魚片的初加工，但生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的下腳料，如魚頭、魚骨等占原料的40%～55%，除了少部分用于飼料魚粉，大多數(shù)被隨意丟棄掩埋，對環(huán)境造成了嚴(yán)重的污染，同時(shí)也形成資源的極大浪費(fèi)[3-4]。

多肽是指分子質(zhì)量在300～3 000 Da之間的一類化合物[5]，易被人體消化吸收。大量研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)多肽被發(fā)現(xiàn)有抗氧化、降血壓、抗腫瘤等多種生理功能[6-8]。提取多肽的方法主要有化學(xué)提取法和酶法，二者相比酶法制備多肽反應(yīng)溫和快速、產(chǎn)物營養(yǎng)價(jià)值高而成為當(dāng)今制備多肽的主流[9]。試驗(yàn)采用酶法制備斑點(diǎn)叉尾鮰魚下腳料的多肽，以水解度為參考指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法探究斑點(diǎn)叉尾鮰魚下腳料酶解的最優(yōu)工藝條件，為斑點(diǎn)叉尾鮰魚下腳料的高值化利用及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

新鮮斑點(diǎn)叉尾鮰魚（市售）；酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、復(fù)合蛋白酶（均為生化級，北京索萊寶科技有限公司）；甲醛、鹽酸、氫氧化鈉等（均為分析純，西隴化工股份有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104IC型電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；K98II型電子調(diào)溫萬用電爐（天津市泰斯特儀器有限公司）；TG16-WS型臺式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）；SHB-Ⅲ磁力攪拌水浴鍋（金壇市良友儀器有限公司）；PE20型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；78HW1型恒溫磁力攪拌器（金壇市憶通電子有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鮰魚下腳料的蛋白質(zhì)含量的測定

參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》。

1.3.2 鮰魚下腳料的酶解工藝

鮰魚下腳料→冷凍干燥→磨粉→稱量→按照一定料液比配成溶液→調(diào)節(jié)酶解pH和溫度→酶解→滅酶→離心取上清液→水解度測定

1.3.3 水解度（Degree of hydrolysis，DH）的測定

采用甲醛電位滴定法[10]對雙孢蘑菇酶解液的水解度進(jìn)行測定，按式（1）～（3）計(jì)算。

式中：ΔV為滴定樣品與滴定蛋白原液所消耗的標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液體積之差；C為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mol/L；W為原料質(zhì)量，g；V總為酶解液的總體積，mL；V為滴定取用的酶解液體積，mL；n0為水解前每克蛋白游離的氨基毫摩爾數(shù)，mmol/g；n為水解后每克蛋白游離的氨基毫摩爾數(shù)，mmol/g；htot為原料蛋白質(zhì)中所含肽鍵總數(shù)，mmol/g；Pro表示樣品的蛋白質(zhì)含量，%。

1.3.4 單因素的測定

1.3.4.1 最適蛋白酶的篩選

將鮰魚下腳料配成料液比1∶30（g/mL）的溶液，分別用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶酶解原料。酶添加量1%，酶解pH、溫度在各酶的最適條件下，反應(yīng)時(shí)間1 h，反應(yīng)結(jié)束沸水浴滅酶10 min，在8 000 r/min下離心10 min，取上清液測定水解度。

1.3.4.2 酶添加量對鮰魚下腳料水解度的影響

將鮰魚下腳料配成料液比1∶30（g/mL）的溶液，酶添加量分別為1%，2%，3%，4%和5%，酶解pH為6.0，置于50 ℃恒溫水浴搖床中酶解1 h，反應(yīng)結(jié)束沸水浴滅酶10 min，在8 000 r/min下離心10 min，取上清液測定水解度。

1.3.4.3 酶解pH對鮰魚下腳料水解度的影響

將鮰魚下腳料配成料液比1∶30（g/mL）的溶液，酶添加量3%，酶解pH分別為4，5，6，7和8，置于50 ℃恒溫水浴搖床中酶解1 h，反應(yīng)結(jié)束沸水浴滅酶10 min，在8 000 r/min下離心10 min，取上清液測定水解度。

1.3.4.4 酶解溫度對鮰魚下腳料水解度的影響

將鮰魚下腳料配成料液比1∶30（g/mL）的溶液，酶添加量3%，酶解pH 5.0，分別置于40，50，60，70和80 ℃恒溫水浴搖床中酶解1 h，反應(yīng)結(jié)束沸水浴滅酶10 min，在8 000 r/min下離心10 min，取上清液測定水解度。

1.3.4.5 酶解時(shí)間對鮰魚下腳料水解度的影響

將鮰魚下腳料配成料液比1∶30（g/mL）的溶液，酶添加量3%，酶解pH 5，置于70 ℃恒溫水浴搖床中分別酶解1，2，3，4，5和6 h，反應(yīng)結(jié)束沸水浴滅酶10 min，在8 000 r/min下離心10 min，取上清液測定水解度。

1.3.5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響顯著的因素，采用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，建立各因素及其交互作用與水解度之間的數(shù)學(xué)模型，探討酶添加量（A）、pH（B）、溫度（C）三個(gè)因素及其交互作用對水解度的影響，確定最優(yōu)的酶解工藝參數(shù)，其因素與水平編碼見表1。

表1 中心組合試驗(yàn)因素水平編碼表

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)獲得，通過Office Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用Origin 7.5軟件繪圖及Design-Expert 8.0進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 最適蛋白酶的篩選

由圖1可知，不同酶的水解效果差異很大，木瓜蛋白酶酶解鮰魚下腳料得到的多肽遠(yuǎn)多于酸性蛋白酶和胰蛋白酶。在初始條件下，木瓜蛋白酶的水解度為31.77%，是酸性蛋白酶的4倍，因此選用木瓜蛋白酶作為后續(xù)的酶解。

圖1 酶的種類對鮰魚下腳料水解度的影響

2.1.2 酶添加量對水解度的影響

由圖2可知，當(dāng)酶添加量為1%～3%時(shí)，反應(yīng)底物在酶的作用下其大分子蛋白被快速降解，使鮰魚下腳料的多肽增加；當(dāng)酶添加量超過3%時(shí)，水解度出現(xiàn)了一定的降低，可能是當(dāng)酶濃度過高時(shí)，酶分子間可能相互水解，導(dǎo)致酶解效果下降[11]。因此，從經(jīng)濟(jì)的角度考慮，木瓜蛋白酶的最佳用量為3%。

圖2 酶添加量對鮰魚下腳料水解度的影響

2.1.3 酶解pH對水解度的影響

由圖3可知，隨著pH的增加，水解曲線呈先上升后緩慢下降的趨勢，當(dāng)pH為5時(shí)，水解度最高，pH為6時(shí)次之，這與木瓜蛋白酶的最適pH接近，說明木瓜蛋白酶在弱酸性環(huán)境下有較好的適應(yīng)性。pH能夠影響底物及酶的解離狀態(tài)、空間結(jié)構(gòu)，從而影響酶與底物的結(jié)合以及酶的活性[12]，因此確定最適pH為5。

圖3 pH對鮰魚下腳料水解度的影響

2.1.4 酶解溫度對水解度的影響

由圖4可知，隨著溫度的提升，水解度呈現(xiàn)緩慢上升后急劇下降的趨勢。酶解溫度在40～70 ℃范圍內(nèi)，溶液中多肽含量隨酶解溫度的升高而逐漸增多，此時(shí)分子運(yùn)動(dòng)加劇，酶活性增加導(dǎo)致水解度提升。當(dāng)溫度超過70 ℃時(shí)，蛋白酶空間結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致酶活力的急劇喪失。因此選定70 ℃為后續(xù)的酶解溫度。

圖4 溫度對鮰魚下腳料水解度的影響

2.1.5 酶解時(shí)間對水解度的影響

由圖5可知，隨著時(shí)間的增加，水解曲線呈先上升后緩慢下降的趨勢。這可能是由于酶解時(shí)間過長，多肽被水解成氨基酸[13]。考慮到成本的問題，因此選擇4 h作為酶解條件。

圖5 時(shí)間對鮰魚下腳料水解度的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化酶解條件

根據(jù)表1的編碼水平設(shè)計(jì)了17組試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。通過 Design Expert 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，建立多元二次響應(yīng)面回歸模型：DH=+40.1+1.52A+2.06B-3.1C-3.14AB-2.62AC-1.54BC-8.45A2-8.82B2-12C2。

由表3可知，模型的p＜0.01，表明該模型是極顯著的，失擬項(xiàng)為0.184 4＞0.05，表明該模型能夠很大程度上擬合真實(shí)的響應(yīng)值變化，決定系數(shù)R2=0.975 1，表明鮰魚下腳料酶解后的水解度變化有97.51%來源于所選變量。通過比對F值和p值的數(shù)據(jù)可以看出，各個(gè)因素的影響主次順序?yàn)闇囟龋久柑砑恿浚緋H。

各因素及交互作用對鮰魚水解度的影響見圖6。曲面越彎曲、等高線形狀越接近橢圓，表示兩因素之間的交互作用對于水解度的影響越大[14]。通過對比表3的AB、BC和AC的p值大小可知，AB即酶添加量和pH的交互作用對于鮰魚水解度具有顯著性影響，各個(gè)因素對于模型和響應(yīng)值的影響并不是簡單的線性關(guān)系。

表2 響應(yīng)面組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析表

圖6 各因素及交互作用對鮰魚水解度的影響

通過軟件處理進(jìn)行最優(yōu)分析，可以得到鮰魚下腳料酶解的最優(yōu)工藝條件：酶添加量3.09%，pH 5.11，溫度68.53 ℃。在該條件下，預(yù)測的響應(yīng)值為40.51%± 0.87%。為適應(yīng)試驗(yàn)條件，將驗(yàn)證酶解條件調(diào)整為酶添加量3%，pH 5.0，溫度69 ℃。在該條件下，水解度為38.89%±0.21%，與理論值較為接近，可見該模型可信，能較好地預(yù)測酶解工藝。

3 結(jié)論

試驗(yàn)從減少資源浪費(fèi)和環(huán)境污染的角度出發(fā)，以斑點(diǎn)叉尾鮰魚的下腳料作為研究對象，探討了不同酶的種類對于水解度的影響。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化木瓜蛋白酶酶解鮰魚下腳料的制備工藝，得到最優(yōu)酶解條件：酶添加量3%，pH 5，溫度69 ℃。在此條件下，酶解液的水解度為38.89%±0.21%，為斑點(diǎn)叉尾鮰魚的高值化利用及附加產(chǎn)品的開發(fā)提供了參考。