小球藻蛋白/海藻酸鈉互穿纖維的制備與特性

1.華東理工大學(xué)食品科學(xué)與工程系，生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海 200237）；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與電氣工程學(xué)院（北京 100083）

小球藻（Chlorella）是一種單細(xì)胞綠藻，也是首先實(shí)現(xiàn)商業(yè)化利用的微藻之一[1]。小球藻不僅以膠囊、片劑、口服液等形式作為保健品銷售，同時(shí)也被廣泛應(yīng)用于飲料、面條、餅干之中[2]。小球藻中含有大量?jī)?yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，占小球藻粉的40%～70%，其氨基酸組成超過FDA（食品及藥物管理局）頒布的用于人類食品的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，研究證明小球藻蛋白及其水解物具有良好的抗氧化能力[3-5]。然而關(guān)于海藻的科學(xué)研究及商業(yè)化應(yīng)用多集中于海藻多糖，對(duì)于海藻蛋白質(zhì)的研究有限[6]，限制了小球藻蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域。

互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（IPN）是由2個(gè)或2個(gè)以上的聚合物網(wǎng)絡(luò)組成的聚合物結(jié)構(gòu)，這些聚合物網(wǎng)絡(luò)在分子層面上相互交錯(cuò)穿插，2種聚合物之間并無共價(jià)鍵連接[7]。如果聚合物體系中只有一種聚合物交聯(lián)形成網(wǎng)絡(luò)，所得結(jié)構(gòu)稱為半互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（semi-IPN）[7]。與單一聚合物形成的結(jié)構(gòu)相比，IPN結(jié)構(gòu)及semi-IPN結(jié)構(gòu)使產(chǎn)品在機(jī)械強(qiáng)度、熱穩(wěn)定性及吸水能力等多個(gè)方面得到改善[8-10]。海藻酸鈉是一種從褐藻中提取出的海藻多糖，是由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古羅糖醛酸組成的線性聚合物，在Ca2+等二價(jià)陽(yáng)離子作用下可迅速形成具有“蛋殼結(jié)構(gòu)”的凝膠[11-13]，常用于構(gòu)建互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。對(duì)于IPN結(jié)構(gòu)的研究主要集中在組分添加量對(duì)于產(chǎn)品性能的影響，對(duì)于組分交聯(lián)度的研究較少。

試驗(yàn)以小球藻蛋白和海藻酸鈉為原料，使用谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（TG酶）和氯化鈣分別交聯(lián)兩種原料形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，通過濕法紡紗制備具有互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠纖維，并探究TG酶添加量對(duì)于凝膠纖維的結(jié)構(gòu)、物化特性及降解過程的影響。通過傅里葉紅外光譜（FT-IR）及小球藻蛋白交聯(lián)度的測(cè)定驗(yàn)證制備凝膠纖維的可行性，進(jìn)而對(duì)凝膠纖維中小球藻蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、凝膠纖維的吸水能力與持水能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。探究凝膠纖維在蛋白酶作用下的降解過程，并對(duì)小球藻蛋白及其酶解物的釋放過程進(jìn)行分析。試驗(yàn)首次將小球藻應(yīng)用于凝膠纖維制作，可為拓展小球藻蛋白的應(yīng)用領(lǐng)域提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海藻酸鈉（南京都萊生物技術(shù)有限公司）；破壁小球藻粉（蛋白質(zhì)含量78%，青島科海生物有限公司）；谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶（2 100 U/g，酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司）；堿性蛋白酶（200 000 U/g，上海騰騫生物科技有限公司）；其他常用化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CP213電子分析天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司）；HHS-I1-1電熱水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SHA-BA恒溫振蕩器（常州朗越儀器制造有限公司）；DL-5-B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；STARTER2100 pH計(jì)（上海華聯(lián)醫(yī)療器械有限公司）；MOV-212F鼓風(fēng)干燥箱（上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）；UV-2000紫外分光光度計(jì)（尤尼克（上海）儀器有限公司）；FTIR5700傅里葉紅外光譜儀（尤尼克（上海）儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 小球藻蛋白/海藻酸鈉互穿結(jié)構(gòu)凝膠纖維制備

采用Sibaja等[14]的方法并稍作修改，通過濕法紡紗制備小球藻蛋白/海藻酸鈉互穿結(jié)構(gòu)凝膠纖維。將小球藻粉溶于100 mL去離子水中，用考馬斯亮藍(lán)法[15]測(cè)定其中蛋白質(zhì)含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=5.66X+0.078（R2=0.999 9），調(diào)節(jié)其中小球藻蛋白質(zhì)量濃度至1 g/100 mL。向溶液中加入1 g海藻酸鈉，磁力攪拌30 min使其完全溶解。添加TG酶至其濃度分別為0，1.0，2.5，5.0，7.5和10.0 U/mL，置于50 ℃水浴下反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，置于90 ℃水浴5 min滅酶。冷卻至室溫后，以5 000 r/min離心15 min除去氣泡，所得樣品即為紡絲液。

將紡絲液裝入配備18G針頭的注射器中，擠壓至100 mL質(zhì)量濃度為10 g/100 mL CaCl2溶液中。2 h后，將凝膠纖維取出，放入去離子水中浸泡1 min后取出，35 ℃下干燥24 h，得到小球藻蛋白/海藻酸鈉互穿結(jié)構(gòu)凝膠纖維。凝膠纖維按照其紡絲液中TG酶濃度分別標(biāo)記為semi-IPN、IPN1、IPN2.5、IPN5、IPN7.5及IPN10。

1.3.2 傅里葉紅外光譜（FT-IR）

將2 mg凝膠纖維與200 mg溴化鉀充分混合后壓片。采用FT-IR5700傅里葉紅外光譜儀對(duì)凝膠纖維的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，波數(shù)范圍4～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.3.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

以所得紅外光譜圖為基礎(chǔ)，參考謝孟峽等[16]的方法對(duì)凝膠纖維中小球藻蛋白的4種二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 小球藻蛋白交聯(lián)度的測(cè)定

小球藻蛋白交聯(lián)度的測(cè)定按照Mi等[17]提出的方法。溶液Ⅰ配制：1.05 g檸檬酸，10 mL濃度為1.0 mol/L的NaOH溶液，0.04 g SnCl2·2H2O混合后，用去離子水定容至25 mL。溶液Ⅱ配制：1 g茚三酮溶解于乙二醇單甲醚中，定容至25 mL。將溶液Ⅰ與溶液Ⅱ混合，磁力攪拌45 min，避光儲(chǔ)存。

將1 mL紡絲液溶解于去離子水中，定容至100 mL。將1 mL稀釋后紡絲液與2 mL茚三酮溶液混合，100 ℃水浴20 min。冷卻至室溫后，加入3 mL 50%異丙醇，在570 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。與茚三酮反應(yīng)后，樣品中游離氨基含量與其在570 nm波長(zhǎng)下吸光度呈正比。樣品中游離氨基含量可代入甘氨酸濃度與其在570 nm下吸光度繪制所得標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計(jì)算Y=2.805X+0.030（R2=0.999 8）。小球藻蛋白交聯(lián)度按式（1）計(jì)算。

式中：M0為不添加TG酶的樣品中游離氨基物質(zhì)的量濃度，mmol/L；Mt為不同TG酶添加量的樣品中剩余游離氨基酸物質(zhì)的量濃度，mmol/L。

1.3.5 吸水能力測(cè)定

將一定質(zhì)量的凝膠纖維置于去離子水中，37 ℃浸泡24 h。取出后用濾紙擦干表面水分，記錄質(zhì)量。凝膠纖維的吸水性按式（2）計(jì)算。

式中：Wd為凝膠纖維干質(zhì)量，g；Ws為凝膠纖維吸水后質(zhì)量，g。

1.3.6 持水能力測(cè)試

將一定質(zhì)量的凝膠纖維置于去離子水中，37 ℃浸泡24 h。以5 000 r/min離心10 min，取出纖維，用濾紙擦干表面水分，記錄質(zhì)量。凝膠纖維的持水性按式（3）計(jì)算。

式中：Wd為凝膠纖維干質(zhì)量，g；Ww為凝膠纖維離心后質(zhì)量，g。

1.3.7 凝膠纖維的酶促降解

凝膠纖維的酶促降解參照Bidault等[18]的方法并稍作修改。將50 mg凝膠纖維浸泡于100 mL生理鹽水中，調(diào)節(jié)pH至8.5，加入堿性蛋白酶至400 U/mL。55 ℃水浴下酶解，每隔1 h，吸取2 mL酶解液，于90 ℃水浴5 min滅酶。每次收集樣品后，將2 mL酶溶液加入反應(yīng)體系來保證酶濃度。試驗(yàn)結(jié)束后，用考馬斯亮藍(lán)法[15]測(cè)定酶解液中釋放的蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)片段含量。一定時(shí)間內(nèi)小球藻蛋白及其酶解物的釋放率為溶液中釋放蛋白質(zhì)片段質(zhì)量與蛋白質(zhì)初始質(zhì)量的比值。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 19.0分析軟件和Origin 8.0軟件處理所得試驗(yàn)結(jié)果，數(shù)據(jù)均為3個(gè)平行樣本，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用ANOVA對(duì)數(shù)據(jù)的差異顯著性進(jìn)行分析（p＜0.05表示差異顯著）。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝膠纖維紅外測(cè)試分析

運(yùn)用傅里葉紅外光譜從定性的角度分析凝膠纖維制備的可行性，小球藻粉、海藻酸鈉、凝膠纖維的紅外光譜如圖1所示。在海藻酸鈉的紅外光譜中，3 420 cm-1的吸收峰是—OH的伸縮振動(dòng)；2 929 cm-1的吸收峰是飽和C—H的伸縮振動(dòng)；1 635與1 417 cm-1的吸收峰則分別對(duì)應(yīng)—COO—的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)和對(duì)稱伸縮振動(dòng)[10]。

在小球藻粉的紅外光譜中，酰胺Ⅰ帶（位于1 700～1 600 cm-1代表C==O伸縮振動(dòng)）與酰胺Ⅱ帶（位于1 590～1 500 cm-1代表N—H彎曲振動(dòng)與C—N伸縮振動(dòng)）分別位于1 651與1 554 cm-1處[19]。3 419 cm-1的吸收峰是—OH伸縮振動(dòng)與N—H伸縮振動(dòng)重疊的結(jié)果[10]。

TG酶添加量不同時(shí)凝膠纖維的紅外光譜均表現(xiàn)出海藻酸鈉與小球藻粉的特征吸收峰，說明兩者具有良好的相容性[20]。與semi-IPN相比，具有IPN結(jié)構(gòu)的凝膠纖維在1 554 cm-1的吸收峰強(qiáng)度略有增強(qiáng)，在1 631 cm-1的吸收峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，說明TG酶成功催化谷氨酰胺與賴氨酸進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)，生成酰胺鍵[21]，形成小球藻蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。具備IPN結(jié)構(gòu)的凝膠纖維均在1 157 cm-1處呈現(xiàn)吸收峰（代表C—O伸縮振動(dòng)），而semi-IPN并無此吸收峰，這可能是由于TG酶的催化作用引發(fā)小球藻蛋白構(gòu)象改變[19]。

圖1 小球藻粉、海藻酸鈉、凝膠纖維的FT-IR曲線

2.2 小球藻蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

通過對(duì)小球藻蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，進(jìn)一步了解不同TG酶添加量對(duì)凝膠纖維結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果如表1所示。數(shù)據(jù)表明，TG酶催化效應(yīng)對(duì)小球藻蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響。與semi-IPN相比，隨著TG酶添加量增加，β-折疊含量從22.83%逐漸下降至17.00%，無規(guī)則卷曲含量從15.58%逐漸上升至24.41%。加入TG酶之后，α-螺旋含量總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，TG酶濃度7.5 U/mL時(shí)達(dá)最低值28.51%。TG酶添加量的改變并未對(duì)β-轉(zhuǎn)角含量造成顯著影響（p＞0.05），只是當(dāng)TG酶濃度1 U/mL時(shí)達(dá)最高值34.41%，顯著高于其他樣品（p＜0.05）。上述現(xiàn)象與Song等[22]研究結(jié)果相似。研究顯示，二級(jí)結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)柔韌性以及強(qiáng)度密切相關(guān)。Zhao等[23]研究發(fā)現(xiàn)α-螺旋含量下降說明分子內(nèi)氫鍵含量降低。Liang等[24]研究發(fā)現(xiàn)β-折疊的穩(wěn)定性高于α-螺旋，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度很大程度上取決于β-折疊含量。Chen等[25]研究發(fā)現(xiàn)無規(guī)則卷曲含量增加則代表蛋白質(zhì)中的高度有序結(jié)構(gòu)展開。結(jié)果表明，隨著TG酶添加量增加，凝膠纖維中小球藻蛋白的結(jié)構(gòu)從有序逐漸向無序轉(zhuǎn)變。

表1 不同TG酶添加量下小球藻蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量 單位：%

2.3 小球藻蛋白交聯(lián)度分析

通過測(cè)定小球藻蛋白的交聯(lián)度，從定量角度分析IPN凝膠纖維制備的可行性。TG酶催化蛋白質(zhì)之間生成ε-（γ-Glu）Lys共價(jià)鍵，從而減少賴氨酸中ε-氨基含量[26]。茚三酮可以測(cè)得樣品中游離氨基含量，進(jìn)而確定交聯(lián)度。如圖2所示，隨著TG酶添加量從1 U/mL上升至10 U/mL，小球藻蛋白交聯(lián)度從9.67%上升至16.26%，表明TG酶成功催化蛋白質(zhì)交聯(lián)并形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，與FT-IR中結(jié)果一致。與此同時(shí)，海藻酸鈉導(dǎo)致紡絲液黏度增高，阻礙TG酶的催化效應(yīng)，導(dǎo)致交聯(lián)度有限[10]。

圖2 不同TG酶添加量下凝膠纖維中小球藻蛋白交聯(lián)度

2.4 吸水能力分析

吸水能力是衡量材料可否應(yīng)用于創(chuàng)面敷料的重要參數(shù)，不同TG酶添加量的凝膠纖維的吸水能力為82.64%～62.76%，如圖3所示。Shi等[27]認(rèn)為凝膠纖維的吸水性與其中親水基團(tuán)的數(shù)量及基團(tuán)親水性強(qiáng)弱密切相關(guān)。在凝膠纖維中，水分子與羥基、羧基等親水基團(tuán)密切結(jié)合，表現(xiàn)出較好的吸水能力。隨著TG酶添加量從0上升至10 U/mL，凝膠纖維的吸水性下降24.06%。盡管TG酶的催化作用使小球藻蛋白結(jié)構(gòu)從有序向無序轉(zhuǎn)變，但是高TG酶添加量使小球藻蛋白的交聯(lián)度增加、網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中網(wǎng)格孔徑降低[28]。致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)阻止水滲透進(jìn)入凝膠纖維之中，從而降低吸水能力。

圖3 不同TG酶添加量對(duì)凝膠纖維吸水性的影響

2.5 持水能力分析

持水能力是影響吸水材料性能的關(guān)鍵因素之一，不同TG酶添加量的凝膠纖維的吸水能力為45.98%～59.48%，如圖4所示。水分析滲透進(jìn)入凝膠纖維之中，與海藻酸鈉、小球藻蛋白形成穩(wěn)定的氫鍵，或與親水基團(tuán)緊密連接，表現(xiàn)出較好的持水能力。隨著TG酶添加量從0上升至10 U/mL，凝膠纖維的吸水能力上升29.36%，這是由凝膠纖維的結(jié)構(gòu)與強(qiáng)度共同導(dǎo)致[29]。TG酶添加量增加催化小球藻蛋白進(jìn)一步交聯(lián)形成更加致密、均勻的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，可有效防止水分流失。與此同時(shí)，TG酶催化形成的ε-（γ-Glu）Lys共價(jià)鍵強(qiáng)度是氫鍵和疏水作用力的20余倍[30]，因此保證凝膠纖維的持水性。

圖4 不同TG酶添加量對(duì)凝膠纖維持水能力的影響

2.6 凝膠纖維的酶促降解過程

經(jīng)過15 h的降解過程，凝膠纖維部分降解，最終形成細(xì)小、均勻的碎片，說明海藻酸鈉與小球藻蛋白在凝膠纖維中均勻分布[18]。溶液中的Na+與凝膠纖維中的Ca2+發(fā)生置換反應(yīng)，海藻酸鈉網(wǎng)絡(luò)裂解[31]，由于不能被堿性蛋白酶催化降解，便以碎片的形式存在。所有樣品中的小球藻蛋白在降解14 h后均完全釋放至酶溶液中，說明盡管小球藻蛋白部分交聯(lián)，但仍對(duì)堿性蛋白酶敏感，使其可以滲透進(jìn)海藻酸鈉網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，催化小球藻蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的裂解[18]。不同TG酶添加量的凝膠纖維在降解過程中的蛋白質(zhì)組分（小球藻蛋白及其酶解物）釋放率如圖5所示。盡管不影響最終釋放量，但TG酶添加量增加明顯減緩蛋白質(zhì)組分的釋放速率（除semi-IPN凝膠纖維外）。TG酶添加量從1 U/mL上升至10 U/mL，蛋白質(zhì)組分完全釋放的時(shí)間從11 h增加至14 h，50%蛋白質(zhì)組分釋放的時(shí)間從4 h增加至11 h。這是由于隨著TG酶添加量增加，凝膠纖維吸水能力降低，阻礙小球藻蛋白網(wǎng)絡(luò)與堿性蛋白酶活性位點(diǎn)的結(jié)合[32]。Semi-IPN中蛋白質(zhì)組分的釋放速率并不是最快，可能是由于蛋白酶僅作用于小球藻蛋白，與IPN結(jié)構(gòu)凝膠纖維中雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)同時(shí)裂解相比，其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)降解速度較慢。

圖5 不同TG酶添加量的凝膠纖維中小球藻蛋白釋放曲線

3 結(jié)論

制備小球藻蛋白/海藻酸鈉凝膠纖維，通過FT-IR及小球藻蛋白交聯(lián)度測(cè)試證明凝膠纖維具備互穿網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)分析顯示，TG酶催化使β-折疊含量減少，無規(guī)則卷曲含量增加，小球藻蛋白結(jié)構(gòu)從有序向無序轉(zhuǎn)變。TG酶添加量的增加賦予凝膠纖維更加致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其吸水能力減弱，持水能力加強(qiáng)。所有的凝膠纖維在蛋白酶以及生理鹽水作用下在14 h之內(nèi)完全降解。TG酶含量從1 U/mL上升至10 U/mL，小球藻蛋白及其酶解物的釋放速率逐漸下降。試驗(yàn)結(jié)果有助于擴(kuò)展小球藻蛋白應(yīng)用領(lǐng)域，為其深層次加工利用提供理論基礎(chǔ)。