棠梨果實中綠原酸提取工藝的優(yōu)化及抗氧化作用

廣東省科學院，廣東省測試分析研究所（中國廣州分析測試中心），廣東省化學危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室（廣州 510070）

棠梨（Pyrus calleryanaDecne）別名杜梨、海棠梨、野梨子，是薔薇科梨屬植物[1]，分布于我國云南、四川、貴州和甘肅等省，長在海拔1 000～1 500 m的高山喜光林中或灌木草原上。我國對于棠梨的應(yīng)用具有悠久的歷史，棠梨味酸、甘、澀、性寒，可全株入藥，其果實具有潤腸通便、消腫止痛、斂肺澀腸以及止咳止痢之效。其根和葉入藥可潤肺止咳、清熱解毒，主要用于治療干燥咳嗽、急性眼結(jié)膜炎等癥[2-4]，在古代多被用于疏肝和胃、緩急止瀉。棠梨具有良好的藥用和保健功能，在食品、保健品和醫(yī)藥行業(yè)有著良好的應(yīng)用前景[5-6]。

目前對于棠梨的相關(guān)研究較少，其果實具有一定的藥用效果，棠梨果實中綠原酸含量較高，具有一定的開發(fā)價值。綠原酸由咖啡酸和奎尼酸縮合而成，具有一定的抗氧化[7]、抗癌[8]、降脂和降血壓[9-10]等作用。此次試驗采用甲醇進行提取，在單因素的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面優(yōu)化法，對棠梨果實中綠原酸進行提取工藝的優(yōu)化。為棠梨果實的開發(fā)與利用提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

棠梨果實（產(chǎn)地江西，樣品干燥至恒質(zhì)量，備用）；綠原酸標準品、蘆丁標準品、抗壞血酸（中國食品藥品檢定研究院）；1,1-2苯基-2-三硝基苯肼、無水甲醇（AR，廣州試劑廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外可見光分光光度計（日本島津公司）；Sartorius電子天平（BSA224S，廣州市深華實驗儀器設(shè)備有限公司）；搖擺式中藥粉碎機（上海頂帥電氣公司）；KQ2200B超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科貿(mào)有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 綠原酸的提取

精密稱取1.0 g粉碎均勻的棠梨果實于離心管中，加入一定體積的甲醇溶液，置于超聲波清洗儀中進行提取，設(shè)定超聲時間與溫度。待提取液冷卻后真空抽濾，將濾液定容至100 mL，將其過0.22 μm針孔過濾器，待測。

1.3.2 綠原酸標準曲線的測定

吸取106.5 μg/mL綠原酸標準溶液于100 mL比色管中，配制成質(zhì)量濃度依次為0.0，4.26，8.52，12.78，17.04，21.30和25.56 μg/mL綠原酸標準品待測溶液。以零管為空白，在波長328 nm處測定標準溶液的吸光度。以綠原酸標準溶液的含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制綠原酸標準曲線，得到回歸方程A=0.051 8C+0.003 000，相關(guān)系數(shù)R=0.999 9。棠梨果實樣品中綠原酸含量根據(jù)標準曲線回歸方程算得，提取率按式（1）計算。

式中：C為樣品中綠原酸含量，μg/mL；V為定容體積，mL；W為稱樣量，g。

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

精密稱取1.0 g粉碎后的棠梨果實，以綠原酸的提取率為指標，研究甲醇體積分數(shù)（40%，50%，60%，70%和80%）、提取溫度（30，40，50，60和70 ℃）、提取時間（10，20，30，40和50 min）、料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL）對棠梨果實中綠原酸提取率的影響。

1.3.4 因素水平設(shè)計

以單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，選擇對棠梨果實中綠原酸提取率有影響的4個因素，采用響應(yīng)面優(yōu)化法中的Box-Behnken設(shè)計進行優(yōu)化試驗。以甲醇體積分數(shù)（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）和料液比（D）為自變量，綠原酸的提取率為響應(yīng)值進行試驗設(shè)計，因素水平設(shè)計如表1所示。

表1 響應(yīng)面分析因素水平

1.3.5 棠梨果實中綠原酸、抗壞血酸、蘆丁抗氧化能力的測定[11-12]

準確稱取23.8 mg DPPH試劑，用70%的甲醇溶液配制成6.0×10-5mol/L DPPH溶液，作為母液于冰箱冷藏備用。吸取10 mL DPPH母液，用70%甲醇定容至100 mL，作為DPPH自由基測定的反應(yīng)試劑。取2 mL不同濃度樣品液，與2 mL DPPH溶液混合，避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長下測定吸光度A1，用2 mL 70%甲醇代替樣品液測得吸光度A0，抗壞血酸作為陽性對照。平行操作重復(fù)3次，清除率按式（2）計算。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 甲醇體積分數(shù)和提取溫度對含量的影響

由圖1（a）可知，隨著甲醇體積分數(shù)增加，綠原酸提取率逐漸增大，當體積分數(shù)為70%時綠原酸提取率達到最大，隨后降低。這是由于綠原酸的分子結(jié)構(gòu)中含多個羥基和羧基的大極性基團。在一般情況下，甲醇體積分數(shù)越低，溶解性越差，綠原酸提取率越少。隨著溶劑體積分數(shù)的增高，提取率逐漸增大，但溶劑體積分數(shù)過高，可以使一些醇溶性雜質(zhì)、色素等溶出量增大，導(dǎo)致綠原酸提取效果不佳，所以才會出現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象。因此，棠梨果實綠原酸提取較適宜的甲醇體積分數(shù)為70%。由圖1（b）可知，隨著溫度的升高，綠原酸的提取率逐漸增大，當提取溫度為60 ℃時提取率達到最大，繼續(xù)升溫則會有所降低。因為溫度過高會導(dǎo)致綠原酸中的酚羥基和羧基被破壞，形成新的物質(zhì)，導(dǎo)致提取率降低。

圖1 甲醇體積分數(shù)與提取溫度對綠原酸提取率的影響

2.1.2 提取時間和料液比對綠原酸提取率的影響

由圖2（a）可知，棠梨果實中綠原酸的提取率隨著提取時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象，提取時間30 min時綠原酸含量最高?？赡苓^長的提取時間使部分綠原酸結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致綠原酸含量降低。因此，選擇30 min為提取時間。由圖2（b）可知，不同料液比對綠原酸提取率影響相對較大。隨著料液比的增大，綠原酸含量逐漸增大，當料液比為1∶30（g/mL）時，綠原酸提取率達到最大，而后達到一個穩(wěn)定作用。因此，棠梨果實綠原酸提取率較適宜的料液比為1∶30（g/mL）。

圖2 提取時間與料液比對綠原酸提取率的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取條件

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果及分析

根據(jù)表1中響應(yīng)面試驗方案，設(shè)計試驗及試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

根據(jù)Design-Expert 7.0軟件的分析結(jié)果可知，該模型p值小于0.000 1，表明模型擬合成功。對綠原酸的提取率采用二次多項式模型分別進行擬合，其方程為

Y提取率=1.26-0.013A-0.026B+0.059C-0.078D+2.750×10-3AB-7.500×10-4AC-0.038AD+1.000×10-3BC+0.036BD+0.044CD-0.15A2-0.13B2-0.041C2-0.084D2（R2=0.990 7）

擬合方程相關(guān)性R＞0.9，其擬合度良好，可用于棠梨果實中綠原酸提取率的優(yōu)化。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

采用Design-Expert 7.0軟件對所得試驗進行響應(yīng)曲面分析，得出兩兩因素之間對棠梨果實中綠原酸提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3和表3中各因素p值可知，提取溫度、提取時間和料液比影響顯著。通過Design-Expert 7.0軟件的分析，最優(yōu)提取條件為甲醇體積分數(shù)70.0%，提取溫度58.5 ℃，提取時間45.2 min，料液比1∶26.4（g/mL）；在該條件下，綠原酸的提取率為1.294%。為方便實際操作，修正最優(yōu)條件為甲醇體積分數(shù)70%，提取溫度58 ℃，提取時間45 min，料液比1∶26（g/mL）。

表2 試驗方案及結(jié)果

表3 棠梨果實中綠原酸提取率的回歸方程方差分析

圖3 兩兩因素交互對棠梨果實中綠原酸提取率提取量的影響

2.2.3 最佳條件驗證

由圖4和表4可知，棠梨果實中綠原酸、VC、蘆丁均具有較強的DPPH自由基清除能力，且清除能力隨著抗氧化樣品溶液濃度的增大而增強。

按2.2.2的最優(yōu)試驗條件，進行6次平行驗證試驗，測得綠原酸的提取率平均值為1.278%，與預(yù)測值接近，且RSD為1.110%，表明響應(yīng)面分析所得的理論最佳提取條件準確可靠。

表4 VC、綠原酸和蘆丁回歸方程與IC50值

圖4 VC、綠原酸和蘆丁對DPPH自由基的清除作用

2.3 金銀花綠原酸提取物的抗氧化能力評價

通過比較三者的半數(shù)清除率IC50可知，棠梨果實綠原酸抗氧化能力略強于VC，蘆丁相比綠原酸及VC，抗氧化能力較差。

3 結(jié)論

以棠梨果實中綠原酸的提取率為指標，探討了不同甲醇體積分數(shù)、料液比、提取時間和提取溫度對綠原酸提取率的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以甲醇體積分數(shù)、料液比、提取時間和提取溫度為影響因素，應(yīng)用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計，以綠原酸的回收率為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析，確定了最佳試驗條件：甲醇體積分數(shù)70%，提取溫度58 ℃，提取時間45 min，料液比1∶26（g/mL）。該條件下綠原酸的提取率達到最大。試驗還考察了棠梨果實中綠原酸的抗氧化活性，其DPPH自由基的半數(shù)清除率為0.935 μg/mL，具有較好的抗氧化活性。因此，此次研究結(jié)果對棠梨的綜合開發(fā)利用具有一定的參考價值。