NIH 稀毛小鼠認(rèn)知情緒等行為學(xué)相關(guān)特性的測定

冀中豪，于小亞，任文陟，陳 健，胡進(jìn)平*

1.長治醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，山西長治 046000；2.吉林省科技創(chuàng)新平臺管理中心，吉林長春 130062；3.吉林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，吉林長春 130062；

實驗小鼠是最常使用的一種模式動物，在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著巨大的作用。NIH 稀毛小鼠是被毛異常的自發(fā)突變鼠，其背景品系是封閉群NIH 小鼠，為常染色體隱性遺傳。毛囊的生長發(fā)育包括形態(tài)發(fā)生和周期循環(huán)兩個階段，目前研究發(fā)現(xiàn)的多種被毛突變小鼠模型主要表現(xiàn)為周期循環(huán)階段的異常，例如典型的Hr 基因突變小鼠表現(xiàn)為漸進(jìn)性脫毛，而NIH 稀毛小鼠屬于形態(tài)發(fā)生期存在異常表現(xiàn)為出生后一直保持稀毛甚至無毛的狀態(tài)。前期研究中對NIH 稀毛小鼠的皮膚結(jié)構(gòu)和免疫相關(guān)的生物學(xué)特性進(jìn)行了觀察和測定，發(fā)現(xiàn)NIH 稀毛小鼠表皮層增厚、毛發(fā)周期轉(zhuǎn)換異常，單增李斯特桿菌感染實驗表明相較于NIH 小鼠其免疫力降低。

使用最廣泛的一種被毛異常小鼠是裸小鼠，其胸腺缺失T 細(xì)胞缺陷而導(dǎo)致的免疫低下使其適用于腫瘤、免疫和感染等相關(guān)方向的研究。裸小鼠最顯著的表型是皮膚被毛異常，關(guān)注于這一表型可以將裸小鼠用于皮膚或毛發(fā)發(fā)育相關(guān)的研究，但是如果錯失了其胸腺缺失免疫缺陷這一表型，將是對這一模型資源的極大浪費。因此，在本研究中，我們將通過生理生化指標(biāo)的測定和行為學(xué)相關(guān)的實驗來分析NIH 稀毛小鼠的相關(guān)生物學(xué)特性，完善其基礎(chǔ)信息，為實驗動物資源的開發(fā)和模型的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6 ～8 周齡的NIH 稀毛小鼠由吉林大學(xué)實驗動物中心提供，SPF 級6 ～8 周齡的NIH 小鼠購于長春生物制品有限公司，所有動物均飼養(yǎng)于吉林大學(xué)實驗動物中心，自由采食飲水，光暗周期12 h/12 h，所有操作符合實驗動物倫理福利規(guī)范的要求，具體實驗動物的分組和數(shù)量見各部分實驗設(shè)計，NIH 小鼠以NIH 表示，NIH 稀毛小鼠以HL 表示。

1.2 主要試劑和儀器

75%乙醇、英雄牌黑墨水、桂龍牌黃帽帶分離膠促凝血液采集管、富士干式生化儀、超凈工作臺、離心機、行為學(xué)配套設(shè)備及分析軟件。

1.3 血清生化指標(biāo)的測定

8周齡雄性NIH稀毛小鼠和NIH小鼠各10只(雄性小鼠適應(yīng)性強，狀態(tài)穩(wěn)定，自身激素影響較小，常用于臟器功能性實驗)，摘眼球采血收集于黃帽采集管，4 000 rpm 離心15 min 收集上清液，使用生化儀上機檢測生化21 項指標(biāo)。

1.4 開放曠場實驗

在60 cm（長）× 60 cm（寬）× 40 cm（高）的非透明無毒材質(zhì)曠場中進(jìn)行試驗。整個場地劃分為4×4 共16 個正方形小塊，中間4 個正方形區(qū)域為內(nèi)區(qū)。開始攝像，選擇一個壁，然后輕輕地將鼠面壁由中點位置放入，記錄5 min 的運動軌跡。隨后使用蒸餾水和75%乙醇擦拭清潔實驗場地，防止排泄物及殘留氣味影響后續(xù)實驗。重復(fù)以上步驟，直到所有小鼠完成實驗。觀察記錄三個指標(biāo)：總的運動距離、內(nèi)區(qū)占比、內(nèi)區(qū)穿越次數(shù)。

1.5 新物體識別實驗

實驗所用場地同上，新物體識別實驗包含三個部分：第一部分習(xí)慣場地（1.4 中已完成），第二部分熟悉舊物體，第三部分測試新物體識別情況。第二部分實驗使用5 cm（長）×5 cm（寬）×8 cm（高）的兩個紅色正方體積木作為舊物體，兩個積木通過雙面膠固定離壁5 cm 處，面向壁側(cè)中央放入小鼠探索活動5 min。第二部分實驗結(jié)束后3 h 進(jìn)行第三部分，實驗時將其中一塊紅色正方體積木更換為黃色球體積木，直徑5 cm，同樣探索活動5 min，記錄小鼠探索新物體和舊物體的實驗占比。實驗設(shè)置為以小鼠鼻尖距物體2 cm 內(nèi)視為對物體有探索行為。

1.6 高架十字迷宮實驗

在所有小鼠進(jìn)行新物體識別實驗的后一天進(jìn)行高架十字迷宮試驗，按照步驟1.6 所述清潔儀器。注：高架迷宮的結(jié)構(gòu)為“十”形。它有兩個張開的手臂（30 cm×5 cm×0.5 cm），彼此交叉，垂直于兩個閉合的手臂（30 cm×5 cm×16 cm），中間有一個平臺（5 cm×5 cm×0.5 cm）。迷宮高出地面40 cm。將小鼠放開臂和閉臂的交界處，記錄5 min的探索行為。觀察記錄小鼠在張開臂（open）和閉合臂（close）中的時間，open/close 表示焦慮程度，記錄活動軌跡圖。

1.7 Morris 水迷宮實驗

實驗所用場地為直徑120 cm、高60 cm 的圓形水池，等分為四個象限。實驗前一天清洗水池并注水，加入6 mL 黑墨水增強小鼠與背景反差，設(shè)置儀器參數(shù)。首先進(jìn)行可視化平臺實驗，即目標(biāo)平臺高于水面在小鼠視野范圍內(nèi)，該實驗結(jié)果將反應(yīng)小鼠的視力和游動速度對后續(xù)實驗的影響；其次進(jìn)行定向航行實驗訓(xùn)練小鼠尋找目標(biāo)平臺，此時目標(biāo)平臺在水下1 cm 處，小鼠無法直接觀察到，實驗結(jié)果反應(yīng)小鼠的學(xué)習(xí)能力，該部分實驗為期4 d，每天訓(xùn)練4 次，每次由不同象限入水；最后進(jìn)行空間探索實驗，將目標(biāo)平臺撤離，小鼠由對側(cè)象限入水，觀察小鼠在目標(biāo)平臺所在象限的停留時間，穿梭進(jìn)入目標(biāo)平臺的次數(shù)等，實驗結(jié)果反應(yīng)小鼠的空間記憶能力。

1.8 統(tǒng)計分析

使用Graphpad Prism 軟件（8.2.1 版本）進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析和繪圖展示，實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用雙尾T 檢驗，*表示p＜0.05、**表示p＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 NIH 稀毛小鼠血清生化指標(biāo)的檢測結(jié)果

血清生化指標(biāo)主要包括肝功能、腎功能、血脂、血糖等指標(biāo)，能夠反應(yīng)肝臟腎臟的基本狀態(tài)。檢測結(jié)果表明，相較于NIH 小鼠，NIH 稀毛小鼠肝功相關(guān)的的ALT、AST 和D-BIL 顯著升高（p＜0.05），CHE、TP 和ALB 顯著升高（p＜0.0001），ALP 顯著降低（p＜0.01）；腎功相關(guān)的BUN 降低（p＜0.05），AU 升 高（p＜0.01）；血 脂 相 關(guān) 的TG 顯 著 升 高（p＜0.05）。結(jié)果指示NIH 稀毛小鼠的肝功和腎功存在異常。相關(guān)結(jié)果見表1。

表1 8 周齡雄性NIH 稀毛小鼠和NIH 小鼠血清生化指標(biāo)

2.2 開放曠場實驗結(jié)果

曠場實驗通過觀察小鼠在場地中間區(qū)域和外周曲線的活動情況，基于運動距離，穿梭次數(shù)和停留時間等指標(biāo)來評價受試物在新異環(huán)境中的活動量和探索情況。5 min 的曠場實驗結(jié)果表明，NIH 稀毛小鼠（HL）與NIH 小鼠（NIH）在活動量上無明顯區(qū)別（圖1A）；但是通過對小鼠在中央?yún)^(qū)域的活動時間（圖1B）和穿入次數(shù)（圖1C）進(jìn)行統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，NIH 稀毛小鼠相較于NIH 小鼠具有更強的探索行為。

2.3 新物體識別實驗和高架十字迷宮實驗結(jié)果

新物體識別實驗通過設(shè)置顏色及性狀各異的兩類探索物，基于小鼠對新異食物的探索偏好度來反應(yīng)小鼠的短時記憶。實驗結(jié)果表明，在5 min 的測試時間中，兩種小鼠的新物體識別能力無明顯區(qū)別（圖2A）；高架十字迷宮則是通過設(shè)置敞臂和開臂兩種探索區(qū)域來測定小鼠的焦慮樣表現(xiàn)。實驗結(jié)果表明，NIH 稀毛小鼠有明顯的焦慮樣行為，具體表現(xiàn)為開閉壁探索比例顯著低于NIH 小鼠（p＜0.0001）（圖2B），運動軌跡圖直接展示了小鼠的探索活動行為（圖2C、D）。

圖1 OFT 實驗結(jié)果

圖2 NOR 實驗和EPM 實驗結(jié)果

2.4 Morris 水迷宮實驗結(jié)果

Morris 水迷宮實驗包含兩個階段的內(nèi)容，能夠?qū)游锏膶W(xué)習(xí)能力和空間記憶能力進(jìn)行評價。首先將目標(biāo)平臺置于水面之上進(jìn)行可視化平臺測試，結(jié)果表明兩組小鼠的視力正常并且游動速度不會影響實驗結(jié)果（圖3A）；為期4 d 的定向航行實驗訓(xùn)練小鼠尋找隱藏的平臺，結(jié)果表明隨著訓(xùn)練的進(jìn)行兩組小鼠的逃避潛伏期逐漸縮短，但兩組之間無明顯區(qū)別（圖3）；圖3C、D 展示了訓(xùn)練第4 天兩組小鼠的運動軌跡。

圖3 Morris 水迷宮定向航行實驗

第5 天撤去隱藏平臺進(jìn)行空間探索實驗，小鼠由目標(biāo)象限對側(cè)入水（圖中右上角圓點表示入水點，下半?yún)^(qū)域圓點表示實驗結(jié)束時小鼠的停留位置），在測試時間60 s 中NIH 稀毛小鼠進(jìn)入目標(biāo)象限的次數(shù)顯著多于NIH 小鼠（圖4A），在目標(biāo)象限的停留時間比例也顯著高于NIH 小鼠（圖4B），表明NIH 稀毛小鼠的空間記憶能力強于NIH 小鼠。圖4C、D 展示兩組小鼠的運動軌跡。

圖4 Morris 水迷宮空間探索實驗

3 討論

小鼠模型是生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中最常使用的模型。被毛突變小鼠是其中的一種，在皮膚光老化、毛發(fā)生長周期的調(diào)控機制、腫瘤、感染和免疫方面有著廣泛的應(yīng)用。NIH 稀毛小鼠是一種自發(fā)性的被毛突變鼠，前期的研究表明其毛囊形態(tài)發(fā)生和周期循環(huán)存在異常，取雌性42 日齡NIH 稀毛小鼠和NIH 小鼠的背部皮膚進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，構(gòu)建了差異基因表達(dá)譜，NIH 稀毛小鼠可以用于毛囊發(fā)育相關(guān)的研究。皮膚是機體免疫的第一道屏障，毛囊的異常影響皮膚穩(wěn)態(tài)，通過單增李斯特桿菌感染實驗對NIH 稀毛小鼠的先天免疫能力進(jìn)行了測定，評估了了腸道菌群對實驗結(jié)果的影響，表明NIH 稀毛小鼠有用于免疫、腫瘤研究的潛力。

為了進(jìn)一步完善NIH 稀毛小鼠的生物學(xué)特性，加深對這一新型實驗動物模型的認(rèn)識，在本研究中對NIH 稀毛小鼠的生理生化指標(biāo)和行為學(xué)相關(guān)的生物學(xué)特性進(jìn)行了測定和分析。結(jié)果表明，NIH 稀毛小鼠的肝功異常，可以嘗試將NIH 稀毛小鼠用于肝炎、肝損傷模型的研究。通過曠場實驗、新物體識別實驗、高架十字迷宮實驗和Morris 水迷宮實驗對NIH 稀毛小鼠的活動量、記憶、探索和焦慮行為進(jìn)行了測定分析，結(jié)果表明NIH 稀毛小鼠的空間記憶能力增強，探索行為增強但是呈現(xiàn)出對高懸開臂的恐懼樣的焦慮行為，NIH 稀毛小鼠在行為學(xué)方面的特性提示其可能適合應(yīng)用于記憶焦慮相關(guān)的藥理或毒理實驗。

此外，NIH 稀毛小鼠是一種自發(fā)突變鼠，遺傳學(xué)實驗表明這是一種常染色體單基因隱性突變，通過全基因組重測序?qū)⑼蛔兓蚨ㄎ坏搅?4 號染色體，對NIH 稀毛小鼠表型的分析將揭示突變基因的潛在功能，為后期突變基因的精細(xì)定位和驗證提供了有利支撐。