慢性乙型肝炎肝纖維化患者的血漿CCL24水平及意義

錢(qián) 川 張紅燕 雷素云

慢性乙型肝炎(CHB)是常見(jiàn)的病毒性肝炎，嚴(yán)重影響著中國(guó)居民的健康[1]。研究顯示，中國(guó)每年約有60萬(wàn)人死于CHB肝硬化及肝細(xì)胞癌[2]。肝纖維化是CHB病程進(jìn)展的重要病理過(guò)程，可進(jìn)展為肝硬化，甚至?xí)T發(fā)肝細(xì)胞癌[3]。肝纖維化的發(fā)病機(jī)制主要是乙型肝炎病毒(HBV)在肝細(xì)胞內(nèi)持續(xù)復(fù)制，誘發(fā)肝細(xì)胞損傷、壞死，同時(shí)激活肝星狀細(xì)胞(HSC)，導(dǎo)致結(jié)締組織增生，細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積[4]。早期判斷肝纖維化程度對(duì)于CHB患者的抗病毒治療及延緩肝纖維化進(jìn)展具有重要意義。目前肝穿刺活組織病理檢查是評(píng)價(jià)肝纖維化程度的金標(biāo)準(zhǔn)[5]，但因具有創(chuàng)傷性，故其臨床應(yīng)用受到限制。瞬時(shí)彈性成像檢查是無(wú)創(chuàng)性評(píng)價(jià)肝纖維化程度的方法[6]，但檢查費(fèi)用較高且有一定技術(shù)要求，其臨床推廣也受到了限制。因此，探究新的無(wú)創(chuàng)性評(píng)價(jià)肝纖維化程度的生物學(xué)標(biāo)志物已成為現(xiàn)今研究的熱點(diǎn)。有研究表明給予蛋氨酸膽堿缺乏飼料飼養(yǎng)的小鼠中，C-C基序趨化因子配體24(CCL24)基因敲除的小鼠肝酶水平低于野生型小鼠，其肝損傷及肝纖維化程度也低于野生型小鼠[7]。由此推測(cè)，檢測(cè)CHB患者的血漿CCL24水平可能對(duì)肝纖維化程度的評(píng)估有一定價(jià)值。本研究探究了CHB肝纖維化患者的血漿CCL24水平及其與肝纖維化程度的關(guān)系，以期為肝纖維化程度的評(píng)估提供新的指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年1月至2020年1月在云南省傳染病醫(yī)院確診的143例CHB患者作為研究對(duì)象。參照《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[8]診斷CHB及肝纖維化程度。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)接受肝穿刺活組織病理檢查；(2)參照上述指南確診為CHB；(3)未接受抗病毒及抗纖維化治療；(4)簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并自身免疫性疾病，如自身免疫性肝炎；(2)合并惡性腫瘤；(3)合并除HBV感染以外的嚴(yán)重感染；(4)合并酒精性肝病或非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)；(5)慢性丙型肝炎。本研究143例CHB患者中，男性102例，女性41例；年齡20～66歲，平均年齡為(45.06±11.10)歲；S0期9例，S1期28例，S2期36例，S3期30例，S4期40例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 臨床信息收集

收集所有CHB患者的年齡、性別，以及肝活組織檢查前1天或當(dāng)天的血漿透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(ⅣC)、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平(ALT)及血小板計(jì)數(shù)(PLT)資料。計(jì)算ARPI指數(shù)和FIB-4指數(shù)，APRI=AST(IU/L)/正常值上限(ULN)/PLT(×109/L)×100%，F(xiàn)IB-4=年齡(歲)×AST(IU/L)/{PLT(×109/L)×[ALT(IU/L)]1/2}。

1.3 肝活組織病理檢查

在超聲引導(dǎo)下將活組織穿刺針插入CHB患者肝部，取出1.5～2 cm長(zhǎng)的肝組織送病理檢查，以評(píng)估肝纖維化程度：(1)S0期 無(wú)肝纖維化發(fā)生；(2)S1期 匯管區(qū)肝纖維化擴(kuò)大，局限竇周或肝小葉內(nèi)纖維化；(3)S2期 肝匯管區(qū)周?chē)w維化，纖維間隔形成，但肝小葉結(jié)構(gòu)保留；(3)S3期 纖維間隔及肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，但未進(jìn)展至肝硬化；(4)S4期 肝硬化[8]?！軸2期視為顯著肝纖維化[9]。

1.4 血漿CCL24水平檢測(cè)

抽取CHB患者肝活組織病理檢查當(dāng)日的晨起肘部空腹靜脈血5 mL，室溫下3 500 r/min離心15 min，離心半徑為8 cm。取離心后上清液，置于-20℃冰箱中保存待驗(yàn)。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法檢測(cè)血漿CCL24水平(人CCL24 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司)，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組基線資料比較

S4期CHB患者的GGT、HA、LN、PCⅢ、ⅣC水平及APRI、FIB-4指數(shù)均高于S0～S1期和S2～S3期患者，PLT水平低于S0～S1期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。S2～S3期CHB患者的GGT、PCⅢ、ⅣC水平及APRI指數(shù)均高于S0～S1期，PLT水平低于S0～S1期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組基線資料比較()/例(%)

2.2 血漿CCL24水平與肝纖維化病理分期的關(guān)系

S0～S1期、S2～S3期和S4期CHB患者的血清CCL24水平分別為(1.16±0.35)μg/L、(1.73±0.40)μg/L和(2.29±0.27)μg/L，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=96.993，P<0.001)。S4期CHB患者的血清CCL24水平高于S0～S1期和S2～S3期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。S2～S3期CHB患者的血清CCL24水平高于S0～S1期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，血漿CCL24水平與CHB患者肝纖維化病理分期呈正相關(guān)(rs=0.763，P<0.001)。

2.3 與顯著肝纖維化和肝硬化相關(guān)的因素分析

顯著肝纖維化(≥S2期)CHB患者的CCL24、GGT、HA、LN、PCⅢ和ⅣC水平[(1.94±0.45)μg/L、(65.48±42.48)U/L、(76.01±23.12)ng/mL、(39.85±20.99)ng/mL、(39.42±16.63)ng/mL和(37.04±12.24)ng/mL]均高于S0～S1期患者(見(jiàn)表1)，PLT水平[(120.27±26.54)×109/L]低于S0～S1期患者(見(jiàn)表1)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.568、7.881、4.007、3.994、9.842、11.801、2.868，P均<0.05)。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，CCL24、HA、PCⅢ和ⅣC水平均是顯著肝纖維化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均<0.05)，見(jiàn)表2。

肝硬化(S4期)CHB患者的CCL24、GGT、HA、LN、PCⅢ和ⅣC水平(見(jiàn)表1)均高于S0～S3期患者[(1.53±0.47)μg/L、(45.06±32.75)U/L、(66.97±16.98)ng/mL、(31.60±14.53)ng/mL、(30.76±13.99)ng/mL和(28.34±10.19)ng/mL]，PLT水平(見(jiàn)表1)低于S0～S3期患者[(130.15±35.78)×109/L]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.262、4.949、4.645、5.400、3.850、6.088、3.206，P均<0.05)。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，CCL24、HA和LN水平均是肝硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P均<0.05)，見(jiàn)表3。

表2 影響顯著肝纖維化的多因素Logistic回歸分析

表3 影響肝硬化的多因素Logistic回歸分析

2.4 各指標(biāo)評(píng)價(jià)顯著肝纖維化和肝硬化的效能

將CCL24、HA、PCⅢ、ⅣC聯(lián)合檢測(cè)評(píng)價(jià)顯著肝纖維化的模型命名為模型X，方程F=-24.363+3.391×CCL24+0.074×HA+0.229×PCⅢ+0.355×ⅣC。將CCL24、HA、LN聯(lián)合檢測(cè)評(píng)價(jià)肝硬化的模型命名為模型Y，方程F=-25.678+6.864×CCL24+0.077×HA+0.121×LN。模型X評(píng)價(jià)顯著肝纖維化的ROC曲線下面積(AUC)為0.991(95%CI：0.959～1.000)，大于APRI指數(shù)[0.781(95%CI：0.704～0.846)]和FIB-4指數(shù)[0.660(95%CI：0.576～0.737)]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=5.486、7.075，P均<0.001)，見(jiàn)表4、圖1。模型Y評(píng)價(jià)肝硬化的ROC曲線下面積為0.981(95%CI：0.943～0.997)，大于APRI[0.793(95%CI：0.718～0.856)]和FIB-4[0.641(95%CI：0.557～0.720)]，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=4.661、5.776，P均<0.001)，見(jiàn)表5、圖2。

表4 各指標(biāo)評(píng)價(jià)顯著肝纖維化的效能

表5 各指標(biāo)評(píng)價(jià)肝硬化的效能

圖1 各指標(biāo)評(píng)價(jià)顯著肝纖維化的ROC曲線

圖2 各指標(biāo)評(píng)價(jià)肝硬化的ROC曲線

3 討論

CHB肝纖維化是HBV誘發(fā)肝細(xì)胞損傷后，機(jī)體的一種代償性修復(fù)反應(yīng)[10]。及時(shí)評(píng)估肝纖維化程度并采取有效治療方案，有可能逆轉(zhuǎn)肝纖維化進(jìn)程[11-14]。然而，目前缺乏動(dòng)態(tài)、無(wú)創(chuàng)、準(zhǔn)確度高且費(fèi)用低的指標(biāo)評(píng)價(jià)CHB患者的肝纖維化程度。本研究分析了血漿CCL24水平在CHB肝纖維化程度評(píng)估中的價(jià)值，以期為肝纖維化的診斷及治療提供參考。

CCL24又名嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子2，可通過(guò)調(diào)控C-C基序趨化因子受體3參與肝細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)及纖維化過(guò)程[7,15]。CCL24還參與了系統(tǒng)性硬化癥、動(dòng)脈粥樣硬化、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及腦脊髓炎等疾病模型，給予抗CCL24單克隆抗體干預(yù)后，炎性反應(yīng)有所緩解[7,16-18]。另有研究證實(shí)CCL24可刺激人肺成纖維細(xì)胞增殖和膠原纖維生成，并與特發(fā)性肺纖維化疾病的進(jìn)展有關(guān)[19-20]。此外，CCL24還可通過(guò)活化成纖維細(xì)胞，同時(shí)介導(dǎo)炎性反應(yīng)，進(jìn)一步加重皮膚纖維化和肺纖維化病情[21]。由此推測(cè)，CCL24可能與肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。

本研究采用ELISA法檢測(cè)血漿CCL24水平，結(jié)果顯示S4期CHB患者的血清CCL24水平高于S0～S1期和S2～S3期患者，S2～S3期CHB患者的血清CCL24水平高于S0～S1期患者，該結(jié)果提示血漿CCL24水平可能與CHB患者的肝纖維化程度有關(guān)，可能參與了肝纖維的發(fā)病及病情進(jìn)展。進(jìn)一步分析CHB患者血漿CCL24水平與肝纖維化病理分期的關(guān)系，結(jié)果顯示兩者呈正相關(guān)，該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了筆者的推測(cè)，即血漿CCL24水平與CHB患者的肝纖維化程度有關(guān)，檢測(cè)CHB患者的血漿CCL24水平有望能評(píng)價(jià)其肝纖維化程度。本研究采用單因素和多因素Logistic回歸分析血漿CCL24水平與顯著肝纖維化和肝硬化的關(guān)系，結(jié)果顯示CCL24、HA、PCⅢ和ⅣC水平是顯著肝纖維化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，CCL24、HA和LN水平是肝硬化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。上述結(jié)果提示CHB患者的血漿CCL24水平與肝纖維化進(jìn)展關(guān)系密切，其水平越高，則肝纖維化程度越嚴(yán)重。

APRI和FIB-4指數(shù)計(jì)算較為簡(jiǎn)單，且相關(guān)指標(biāo)檢查費(fèi)用較低，已被歐洲肝病學(xué)會(huì)(EASL)指南推薦為評(píng)估慢性丙型肝炎肝纖維化程度的重要參考指標(biāo)，尤其適用于不發(fā)達(dá)地區(qū)[22]。目前已有研究表明APRI和FIB-4指數(shù)可輔助評(píng)價(jià)CHB患者肝纖維化程度，指導(dǎo)抗肝纖維化治療[23-24]。本研究將CCL24納入評(píng)價(jià)肝纖維化程度的模型X、Y中，結(jié)果顯示模型X評(píng)價(jià)顯著肝纖維化的AUC為0.991，大于APRI指數(shù)(0.781)和FIB-4指數(shù)(0.660)；模型Y評(píng)價(jià)肝硬化的AUC為0.981，大于APRI指數(shù)(0.793)和FIB-4指數(shù)(0.641)；該結(jié)果提示檢測(cè)CHB患者的血漿CCL24水平有助于評(píng)價(jià)肝纖維化程度，其構(gòu)建的診斷模型具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，CHB患者的血漿CCL24水平越高，其肝纖維化程度越嚴(yán)重，檢測(cè)CHB患者的血漿CCL24水平有助于評(píng)價(jià)肝纖維化程度，以便指導(dǎo)抗病毒和抗纖維化治療。納入CCL24的診斷顯著肝纖維化的模型X和診斷肝硬化的模型Y均具有較高的診斷效能，對(duì)肝纖維化程度評(píng)價(jià)有重要臨床意義。本研究明確了CCL24在肝纖維化程度評(píng)價(jià)方面的價(jià)值，今后將繼續(xù)深入研究以明確CCL24參與肝纖維化發(fā)生及發(fā)展的病理生理機(jī)制。