隱匿性腫瘤細(xì)胞在pN0期胃癌患者中的檢出率及對(duì)預(yù)后的影響

葉嬋娟 吳仲平 陳仲華

區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者預(yù)后的重要因素[1]。部分早期胃癌患者即使接受了根治性胃切除術(shù)，仍然會(huì)在短期內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。Liu等[2]的研究顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性(pN0)胃癌患者的復(fù)發(fā)率為28%～47%。因此，當(dāng)采用傳統(tǒng)的蘇木精-伊紅(HE)染色評(píng)估胃癌患者的淋巴結(jié)病理分期(pN)時(shí)，部分被診斷為pN0期的患者臨床分期可能被低估。隱匿性腫瘤細(xì)胞(OTC)可能在pN0期患者的復(fù)發(fā)中發(fā)揮了重要作用。淋巴結(jié)內(nèi)的OTC根據(jù)腫瘤細(xì)胞群的直徑大小可分為微轉(zhuǎn)移(MM)和孤立腫瘤細(xì)胞(ITC)兩種[3]。目前，MM和ITC與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系尚未明確。有研究認(rèn)為淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移(LNMM)是影響胃癌復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素，并提出腫瘤細(xì)胞的高增殖活性可能促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)的假說[4]。Tavares等[5]綜合分析了24篇文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，大部分研究認(rèn)為OTC與胃癌患者的預(yù)后不良存在相關(guān)性，但目前OTC在中國(guó)人群中仍缺少相關(guān)研究數(shù)據(jù)。本研究探討了OTC在pN0期胃癌患者中的檢出率及對(duì)預(yù)后的影響，旨在為進(jìn)一步改善早期胃癌患者的預(yù)后提供更多依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究為回顧性隊(duì)列研究，選擇2010年1月至2015年1月浙江金華廣福腫瘤醫(yī)院收治的73例pN0期胃癌患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)接受根治性手術(shù)，手術(shù)方式包括全胃切除或部分R0胃切除、D2淋巴結(jié)清掃；(2)無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的臨床證據(jù)；(3)未接受過新輔助化學(xué)治療或放射治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)因手術(shù)并發(fā)癥死亡或失訪；(2)臨床資料或隨訪資料不完全。73例患者中，男性35例，女性38例，年齡36～81歲，平均年齡為(63.5±11.5)歲。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 臨床資料收集及隨訪

通過本院電子病歷系統(tǒng)獲取患者的臨床資料。所有納入的患者均根據(jù)方案進(jìn)行了系統(tǒng)的隨訪，包括對(duì)臨床病史、體檢及血細(xì)胞計(jì)數(shù)的完整評(píng)估。所有患者均通過門診或電話隨訪，隨訪截止時(shí)間為2019年12月，術(shù)后第1年每3個(gè)月隨訪1次，從術(shù)后第2年開始，每6個(gè)月隨訪1次，直至患者死亡或隨訪截止。此外，定期或在臨床需要時(shí)進(jìn)行影像學(xué)檢查(胸腹盆腔計(jì)算機(jī)斷層掃描)和內(nèi)窺鏡檢查。主要臨床資料包括患者的年齡、性別和外科手術(shù)類型等，病理評(píng)估包括腫瘤的位置、大小、組織學(xué)類型、是否存在淋巴管浸潤(rùn)或血管浸潤(rùn)等。根據(jù)《日本胃癌處理規(guī)約》第14版將腫瘤發(fā)生部位分為胃上部、胃中部和胃下部。依據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)出版的第8版《AJCC腫瘤分期手冊(cè)》中的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行腫瘤分期。組織學(xué)類型按照Lauren分類系統(tǒng)分為腸型或彌漫型[6]。

1.3 OTC的定義及免疫組織化學(xué)檢測(cè)

根據(jù)第8版《AJCC腫瘤分期手冊(cè)》，淋巴結(jié)陽(yáng)性的OTC樣本根據(jù)腫瘤細(xì)胞群的大小被分類為MM或ITC。MM被定義為直徑在0.2～2.0 mm的腫瘤細(xì)胞群；ITC被定義為最大直徑<0.2 mm的腫瘤細(xì)胞群，通常缺乏間質(zhì)反應(yīng)。每例淋巴結(jié)樣本在不同水平上進(jìn)行3個(gè)切片，所有手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟切片，厚度為4 μm，標(biāo)本先經(jīng)HE染色，若判斷為陰性淋巴結(jié)，則再行角蛋白抗體AE1/AE3免疫組織化學(xué)染色。組織切片脫蠟，梯度乙醇脫水，微波10 min進(jìn)行抗原修復(fù)，然后與抗AE1/AE3一抗(1∶50稀釋)孵育過夜，將生物素標(biāo)記的二抗和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素與樣品共同孵育，DAB法染色。免疫組織化學(xué)染色的淋巴結(jié)切片由兩位觀察者分別評(píng)估，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色。根據(jù)染色結(jié)果將患者分為3組：無OTC組(n=43)、MM組(可同時(shí)合并ITC，n=20)和ITC組(n=10)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。Kolmogorov-Smirnov(K-S)檢驗(yàn)用于正態(tài)分布檢驗(yàn)，Levene檢驗(yàn)用于方差齊性檢驗(yàn)。采用卡方檢驗(yàn)和Fisher檢驗(yàn)來評(píng)估分類變量之間的相關(guān)性，采用t檢驗(yàn)評(píng)估數(shù)值變量的相關(guān)性。生存情況采用Kaplan-Meier法分析，Log-rank檢驗(yàn)分析組間生存差異。使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響患者生存率的因素。

2 結(jié)果

2.1 患者的臨床病理特點(diǎn)

本研究共納入73例pN0期胃癌患者，其中49%的腫瘤位于胃下部，36%的患者為T1期，腫瘤以腸腺癌為主(66%)，淋巴管浸潤(rùn)占44%，血管浸潤(rùn)占47%。24例患者(33%)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，全組病死率為27%。在復(fù)發(fā)的患者中，14例出現(xiàn)局部病變，7例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，3例兩種情況同時(shí)發(fā)生。由表1可知，OTC與患者的復(fù)發(fā)、死亡顯著相關(guān)。

表1 各組患者的臨床病理特點(diǎn)

2.2 OTC免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

73例患者中有30例(41%)檢測(cè)出OTC，其中20例檢測(cè)出MM(18例合并ITC)，10例僅檢測(cè)出ITC。術(shù)中共分離出1 257枚淋巴結(jié)，其中90枚淋巴結(jié)顯示有OTC，陽(yáng)性率約為7%。MM出現(xiàn)在38枚淋巴結(jié)中，ITC出現(xiàn)在83枚淋巴結(jié)中。在20例MM陽(yáng)性患者中，受累淋巴結(jié)數(shù)目為70枚，平均每例患者3.5枚。在10例僅有ITC的患者中，受累淋巴結(jié)數(shù)目為20枚，平均每例患者2.0枚。具體見圖1。

2.3 MM和ITC陽(yáng)性淋巴結(jié)數(shù)目與臨床病理特征的關(guān)系

臨床病理分析顯示，MM陽(yáng)性淋巴結(jié)數(shù)目與胃癌分化類型、淋巴管浸潤(rùn)發(fā)生率密切相關(guān)(P<0.05)，彌漫型、合并淋巴管浸潤(rùn)的胃癌患者淋巴結(jié)MM陽(yáng)性率明顯較高(P<0.05)。ITC陽(yáng)性淋巴結(jié)數(shù)目與T分期、淋巴管浸潤(rùn)發(fā)生率密切相關(guān)(P<0.05)，T分期較高、合并淋巴管浸潤(rùn)的胃癌患者淋巴結(jié)ITC陽(yáng)性率明顯較高(P<0.05)。見表2。

圖1 OTC免疫組織化學(xué)染色圖 SP法 ×400 A MM陽(yáng)性 B ITC陽(yáng)性

表2 MM和ITC陽(yáng)性淋巴結(jié)數(shù)目與臨床病理特征的關(guān)系/枚

2.4 影響患者生存率的Cox多因素分析

隨訪結(jié)果顯示有20例患者死亡，病死率為27%。將臨床病理特征納入Cox回歸分析，單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤直徑、分化類型、淋巴管浸潤(rùn)、OTC、MM、ITC可能是影響患者預(yù)后的因素；多因素分析結(jié)果顯示，腫瘤直徑、分化類型、淋巴管浸潤(rùn)、OTC、MM、ITC均是影響患者生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表3。

表3 影響患者生存率的Cox多因素分析

2.5 不同OTC狀態(tài)患者的生存率比較

73例患者的中位生存時(shí)間為84個(gè)月，OTC陽(yáng)性組的中位生存時(shí)間為68個(gè)月，其中ITC陽(yáng)性組為73個(gè)月，MM陽(yáng)性組為63個(gè)月，而OTC陰性組為93個(gè)月。Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，OTC陰性組患者的生存率顯著高于OTC陽(yáng)性組(χ2=8.146，P=0.004)。對(duì)OTC陽(yáng)性組進(jìn)一步行亞組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OTC陰性組、ITC陽(yáng)性組及MM陽(yáng)性組患者的生存率存在顯著差異(χ2=11.12，P=0.003)；兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，ITC陽(yáng)性組及MM陽(yáng)性組的生存率均顯著低于OTC陰性組(P均<0.05)。見圖2。

圖2 不同OTC狀態(tài)患者的生存率比較 A OTC陽(yáng)性組、OTC陰性組患者的生存曲線 B OTC陰性組、ITC陽(yáng)性組及MM陽(yáng)性組患者的生存曲線

3 討論

在過去的30年里，多個(gè)版本的TNM分期系統(tǒng)對(duì)胃癌淋巴結(jié)的分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了調(diào)整。第8版《AJCC腫瘤分期手冊(cè)》將胃癌T1N3bM0期和T2N3bM0期分別歸類為ⅡB期和ⅢA期，T3N3bM0被重新歸類為ⅢB期，強(qiáng)調(diào)了術(shù)中足夠數(shù)量淋巴結(jié)清掃的重要意義，相較于之前版本突出了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等特殊轉(zhuǎn)移方式潛在的臨床價(jià)值，但仍然未將OTC納入分期系統(tǒng)的考慮因素，這主要是由于目前相關(guān)研究結(jié)論尚存在爭(zhēng)議。目前檢測(cè)胃癌淋巴結(jié)中OTC常用的單克隆抗體為AE1/AE3[7]。Cai等[8]的研究發(fā)現(xiàn)，在被診斷為pN0期胃癌的患者中，仍有34%的患者檢測(cè)出OTC陽(yáng)性。Miyake等[9]報(bào)道指出，將每枚淋巴結(jié)的切片數(shù)量增加至3片，可以獲得與反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法相近的敏感度。因此，本研究選擇在每枚淋巴結(jié)的不同水平上進(jìn)行3個(gè)切片，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。Horstmann等[10]的研究表明，pN0期胃癌患者中OTC的陽(yáng)性率可達(dá)59%，提示傳統(tǒng)的HE染色法嚴(yán)重低估了pN0期胃癌患者的分期。本研究結(jié)果顯示，MM的檢出率為27%，ITC為38%，且OTC的存在與臨床病理特征有關(guān)，提示OTC與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性。

邊緣淋巴竇是淋巴循行通道，是淋巴從輸入管進(jìn)入淋巴結(jié)的必經(jīng)之路，也是淋巴結(jié)抵御腫瘤細(xì)胞侵襲的門戶。Harrison等[11]分析了pT1～4N0期腫瘤患者的5年生存率后發(fā)現(xiàn)，與免疫組織化學(xué)染色顯示淋巴結(jié)陰性的患者相比，淋巴結(jié)陽(yáng)性患者的5年生存率顯著降低。Yonemura等[12]的研究顯示，早期胃癌中ITC的增殖率為46.6%，提示ITC的存在與預(yù)后不良有關(guān)。但也有部分研究認(rèn)為OTC與患者預(yù)后之間沒有相關(guān)性。Fukagawa等[13]的研究納入了107例pT2～3N0期胃癌患者，結(jié)果表明LNMM的存在對(duì)患者的5年生存率和10年生存率均無顯著影響；Morgagni等[14]的研究納入了300例pN0期胃癌患者，同樣發(fā)現(xiàn)患者的5年生存率和10年生存率均不受LNMM的影響。本研究結(jié)果顯示，67%的復(fù)發(fā)患者合并有OTC，無OTC的pN0期患者與合并MM者的中位生存時(shí)間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在73例pN0期胃癌患者中有20例有MM，10例僅有ITC；生存分析結(jié)果表明，OTC對(duì)患者生存率有顯著不良影響。因此，本研究更傾向于在進(jìn)行胃癌分期及預(yù)后判斷時(shí)，將OTC作為一項(xiàng)重要的參考因素。胃切除加區(qū)域淋巴結(jié)清掃是目前胃癌的標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)方法。然而，較大的手術(shù)范圍與患者生活質(zhì)量的長(zhǎng)期下降有關(guān)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移一般發(fā)生在前哨淋巴結(jié)。有研究指出，如果所有的前哨淋巴結(jié)都沒有腫瘤轉(zhuǎn)移，根據(jù)術(shù)中診斷，患者應(yīng)接受有限的胃切除術(shù)，如部分或節(jié)段性胃切除加淋巴結(jié)清掃；但對(duì)于前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性的患者，標(biāo)準(zhǔn)的胃切除加區(qū)域淋巴結(jié)清掃是十分必要的[15]。OTC的存在將對(duì)患者的預(yù)后產(chǎn)生重大影響，可直接影響治療策略的選擇，因此檢測(cè)OTC具有重要意義。

綜上所述，部分pN0期胃癌患者淋巴結(jié)中OTC的檢出率較高，這對(duì)患者的預(yù)后有明顯不良影響，應(yīng)在胃癌淋巴結(jié)評(píng)估中將OTC作為考慮因素。