PKM2在克羅恩病組織中的表達(dá)及意義

張 磊 楊 琳 王宏彬 周 怡

克羅恩病(CD)是一種炎癥性腸病，目前病因尚未完全闡明[1]。CD的病變特點(diǎn)為腸道炎性反應(yīng)遷延不愈，且多累及回腸末端，嚴(yán)重時(shí)可并發(fā)腸狹窄、梗阻、穿孔或肛周病變[2-3]。盡早評(píng)估CD患者疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后對(duì)后續(xù)治療具有重要意義。白細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白等炎性反應(yīng)指標(biāo)可評(píng)估CD疾病嚴(yán)重程度，但敏感度或特異度較低[4]。因此，亟需探究能夠準(zhǔn)確評(píng)估CD患者疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后的生物標(biāo)志物。腸黏膜在阻止胃腸道病菌侵入機(jī)體及維持全身免疫系統(tǒng)方面發(fā)揮著重要作用。CD發(fā)病時(shí)可使腸黏膜受損而發(fā)生炎性反應(yīng)，致使腸上皮細(xì)胞凋亡。研究表明，M2型丙酮酸激酶(PKM2)的上調(diào)可通過(guò)調(diào)控B細(xì)胞淋巴瘤-XL(Bcl-XL)蛋白表達(dá)保護(hù)腸上皮細(xì)胞，使其免于凋亡[5]。本文檢測(cè)了CD組織中PKM2蛋白的表達(dá)水平，并探究其評(píng)估CD患者疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2015年3月至2017年8月在上海市浦東新區(qū)浦南醫(yī)院就診的126例CD患者作為研究對(duì)象，設(shè)為CD組。根據(jù)《中國(guó)炎癥性腸病組織病理診斷共識(shí)意見(jiàn)》[6]中關(guān)于CD診斷的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡18～60歲；(2)接受結(jié)直腸鏡檢查；(3)簽署了知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并除CD以外的自身免疫性疾??；(2)入組前服用過(guò)抗炎藥物；(3)合并嚴(yán)重心、肝、腎等臟器功能異常；(4)合并急性感染性腸炎；(5)合并惡性腫瘤；(6)不能配合隨訪(fǎng)。另選取同期在本院接受結(jié)直腸鏡檢查并切除腸息肉組織的52例患者作為對(duì)照組。CD組中男性81例，女性45例，年齡28～54歲，平均年齡為(40.25±5.45)歲；對(duì)照組中男性33例，女性19例，年齡29～50歲，平均年齡為(38.64±4.28)歲。兩組的性別(χ2=0.011，P=0.917)、年齡(t=0.720，P=0.472)相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 信息收集 收集受試者的年齡、性別、吸煙史、病變位置、上消化道受累、C反應(yīng)蛋白、紅細(xì)胞沉降率、疾病行為和肛周病變等臨床信息。C反應(yīng)蛋白>8 mg/L定義為升高，紅細(xì)胞沉降率>15 mm/h定義為升高。

1.2.2 PKM2蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)CD組織及息肉組織中PKM2蛋白表達(dá)水平[7]。于結(jié)直腸鏡檢查時(shí)留取受試者CD組織和息肉組織的病理標(biāo)本，將RIPA裂解液分別滴加至盛有CD及息肉組織的容器中，提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行定量。然后，滴加勻漿緩沖液在4 ℃的離心機(jī)中以3 500 r/min離心15 min，取上清液。電泳100 min至溴酚藍(lán)跑出膠面，緩沖液漂洗，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中轉(zhuǎn)膜。PBS洗膜，加入兔抗人PKM2抗體(購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司)，4 ℃孵育過(guò)夜。PBST漂洗，加入山羊抗兔二抗(購(gòu)自武漢益普生物科技有限公司)，室溫孵育1 h。曝光顯影，采用ImageJ軟件進(jìn)行光密度分析。

1.2.3 CD疾病嚴(yán)重程度評(píng)估 采用CD簡(jiǎn)化內(nèi)鏡評(píng)分(SES-CD)評(píng)估CD患者的疾病嚴(yán)重程度[8]。SES-CD評(píng)分將腸道分為末端回腸、右半結(jié)腸、橫結(jié)腸、左半結(jié)腸和直腸5個(gè)部分，參考以下4個(gè)維度：潰瘍大小、潰瘍面積、受累腸道面積及腸腔狹窄情況，各維度評(píng)分均為0～3分，分?jǐn)?shù)越高表示越嚴(yán)重。SES-CD 評(píng)分為各維度評(píng)分之和，0～3分為緩解，4～10分為輕度活動(dòng)，11～19分為中度活動(dòng)，20分及以上為重度活動(dòng)。

1.2.4 預(yù)后評(píng)估 采用電話(huà)隨訪(fǎng)方式了解CD患者的預(yù)后情況。CD患者出院3個(gè)月后開(kāi)始隨訪(fǎng)，了解其2年內(nèi)的并發(fā)癥、手術(shù)及CD相關(guān)死亡情況，隨訪(fǎng)終點(diǎn)為患者死亡或末次隨訪(fǎng)時(shí)間(2019年8月20日)。將發(fā)生腸瘺、復(fù)雜肛瘺、腸穿孔、消化道大出血、腹腔膿腫、腸梗阻等并發(fā)癥，接受腸切除手術(shù)治療，以及CD相關(guān)死亡判定為預(yù)后不良[9]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PKM2在CD組織中的表達(dá)

CD組PKM2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.47±0.11，低于對(duì)照組(1.08±0.14)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=31.250，P<0.001)。

2.2 PKM2與CD疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系

CD組患者平均SES-CD評(píng)分為(8.85±2.41)分。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CD組患者PKM2蛋白表達(dá)水平與SES-CD評(píng)分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.891，P<0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 PKM2與SES-CD評(píng)分關(guān)系的散點(diǎn)圖

2.3 PKM2在不同預(yù)后的CD患者中的表達(dá)

隨訪(fǎng)發(fā)現(xiàn)，126例CD患者中有40例(31.75%)預(yù)后不良，包括5例(3.97%)腸瘺，6例(4.76%)復(fù)雜肛瘺，3例(2.38%)腸梗阻，4例(3.17%)腹腔膿腫，3例(2.38%)消化道大出血，19例(15.08%)接受腸切除手術(shù)治療。預(yù)后不良的CD患者PKM2蛋白相對(duì)表達(dá)量為0.34±0.05，低于預(yù)后良好的CD患者(0.53±0.08)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.432，P<0.001)。

2.4 PKM2與CD患者預(yù)后的關(guān)系

預(yù)后不良患者和預(yù)后良好患者在年齡、性別、吸煙史、病變位置、上消化道受累、C反應(yīng)蛋白和紅細(xì)胞沉降率方面比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；在疾病行為和肛周病變方面比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

將可能與CD患者預(yù)后有關(guān)的因素，包括上消化道受累(非上消化道受累=0，上消化道受累=1)、疾病行為(非狹窄非穿透型=0，狹窄型=1，穿透型=2)、肛周病變(非肛周病變=0，肛周病變=1)和PKM2蛋白表達(dá)水平(原始值錄入)作為自變量，納入標(biāo)準(zhǔn)α≤0.1，將CD患者的預(yù)后情況作為因變量，納入多因素Logistic回歸模型分析，結(jié)果顯示疾病行為、肛周病變和PKM2蛋白表達(dá)水平與CD患者預(yù)后關(guān)系密切(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1 影響CD患者預(yù)后的單因素分析

表2 影響CD患者預(yù)后的多因素Logistic回歸分析

3 討論

CD發(fā)病過(guò)程中，白細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白、血小板計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞沉降率、血紅蛋白和白蛋白水平等炎性反應(yīng)指標(biāo)將發(fā)生變化，但上述指標(biāo)在判斷CD疾病嚴(yán)重程度方面存在不足，敏感度或特異度較低，臨床價(jià)值有限[10-16]。結(jié)直腸鏡檢查是評(píng)估CD疾病嚴(yán)重程度的金標(biāo)準(zhǔn)，但患者接受度較低，操作較為繁瑣，且難以多次進(jìn)行。因此，探尋敏感度和特異度均較高且操作便捷的指標(biāo)尤為重要。

PKM2是一種糖酵解關(guān)鍵代謝酶，在機(jī)體內(nèi)以二聚體或四聚體形式存在[17]。二聚體的活性較低，主要存在于腫瘤細(xì)胞中；而四聚體的活性較高，主要存在于正常的、處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞中[18]。研究表明，PKM2可催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸，同時(shí)生成三磷酸腺苷，維持細(xì)胞增殖和代謝[19-21]。此外，PKM2還可以調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路及Bcl-XL蛋白表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡[5,22]。

本研究結(jié)果顯示，CD組PKM2蛋白的表達(dá)水平低于對(duì)照組，提示PKM2可能與CD的發(fā)病有關(guān)。SES-CD評(píng)分可反映CD患者的疾病嚴(yán)重程度。本研究發(fā)現(xiàn)，PKM2蛋白表達(dá)水平與SES-CD評(píng)分呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示PKM2可能參與了CD的疾病進(jìn)展過(guò)程。基于上述結(jié)果，本文比較了不同預(yù)后的CD患者PKM2蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示預(yù)后不良CD患者的PKM2蛋白表達(dá)水平低于預(yù)后良好者，提示PKM2與CD患者的預(yù)后密切相關(guān)。多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，疾病行為、肛周病變情況和PKM2蛋白表達(dá)水平與患者的預(yù)后關(guān)系密切。

綜上所述，CD患者PKM2蛋白表達(dá)水平越低提示其病情越嚴(yán)重。狹窄型或穿透型CD、合并肛周病變及低PKM2蛋白表達(dá)水平的CD患者發(fā)生預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)較高。檢測(cè)CD組織中PKM2蛋白表達(dá)水平有助于評(píng)估CD患者的疾病嚴(yán)重程度和預(yù)后。本研究存在一定的不足之處，如入組患者的病程長(zhǎng)短不一，可能使結(jié)果存在一定偏倚；未在治療過(guò)程中檢測(cè)CD組織中PKM2蛋白的表達(dá)水平，了解其動(dòng)態(tài)變化及對(duì)療效的評(píng)估價(jià)值。今后將針對(duì)以上不足開(kāi)展多中心研究和基礎(chǔ)研究，以闡明PKM2在CD發(fā)病及進(jìn)展中的作用。