風味物質4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的研究進展

李青卓，王嘉瑞，張小龍，付彩霞，汪 超，徐 寧，呂文平*

（1.湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院 湖北省食品發(fā)酵工程技術研究中心，湖北 武漢 443000；2.湖北土老憨生態(tài)農業(yè)科技股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

近年來，隨著天然產品的流行，使得人們對香氣成分的興趣日益增加，4-乙烯基衍生物被監(jiān)管機構批準為調味劑[2]和肉類產品的保存劑。除了具有作為香料和添加劑的商業(yè)價值外，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚由于其抗氧化活性和抗癌活性[3]，在醫(yī)藥制品領域，如用于眼科領域，作為隱形眼鏡溶液和滴眼劑[4]也存在潛在的藥用價值。近年來，全球市場對天然芳香化合物的需求逐步增長，所以，尋找安全高效的天然4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的生物合成途徑是很有必要的。

1 4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的結構及其理化性質

4-乙烯基愈創(chuàng)木酚為乙烯基酚衍生物，一種吡喃花青素，是包括香草醛在內的一組芳香族單體酚成員，在食品工業(yè)中被廣泛用作調味劑。其分子式為C9H10O2，密度1.11×103kg/m3，熔點26～29 ℃，沸點100 ℃/667 Pa。天然4-乙烯基愈創(chuàng)木酚主要存在于玉米酒精發(fā)酵的揮發(fā)物中，為無色或淡黃色油狀液體，有發(fā)酵氣息、微帶甜味和獨特的酚感，不溶于水，但溶于甲醇和油類。4-乙基烯愈創(chuàng)木酚的分子結構如下：

4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的分析檢測方法數(shù)量有限，該領域早期工作主要采用氣相色譜法，但是此方法較為復雜且耗時較長。近年來，人們對高效液相色譜法使用較為普遍，MADIGAN D等[5]確定了一種高效液相色譜法測定麥汁、啤酒中的4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的含量，該方法簡單快速，結果準確，精密度高，其次還有頂空固相微萃取-氣質聯(lián)用、熒光檢測等方法[6]。

2 4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的生物合成

目前，市場上的4-乙烯基愈創(chuàng)木酚多采用化學法合成，需要較多的前體物質。有些還需要較為劇烈的條件，如高溫高壓，微波加熱誘導脫羧等[7]。但化學合成法生產出的產品都不屬于天然物質。由于4-乙烯基愈創(chuàng)木酚很大一部分用于香精、醫(yī)藥及食品工業(yè)，而化學合成品用于這些行業(yè)有很大的不安全性。所以，尋找快速安全生產4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的生物合成途徑是很有必要的?，F(xiàn)有研究報道4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的生物合成法有微生物發(fā)酵法、植物細胞培養(yǎng)法和酶法。

2.1 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法是指微生物在適宜的條件下，對底物進行分解和利用從而轉化為人類所需產物的過程，它的優(yōu)點是避免使用重金屬，有機溶劑以及強酸和強堿，因此合成過程對環(huán)境友好，并且因其生產成本較低，所以微生物發(fā)酵法成為近年來生產4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的研究趨勢。已有研究表明，多種細菌和真菌能夠將阿魏酸脫羧轉化為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚[8]。

MISHRA S等[9]綜述了微生物催化阿魏酸轉化為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的7種不同代謝途徑。具體途徑如下：

以上代謝途徑表明了阿魏酸生物轉化為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的過程中微生物以及其他高附加值化合物呈現(xiàn)多樣性。在途徑1中[10]，阿魏酸經(jīng)醌型中間體物質轉化為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，并進一步轉化成另一種醌型中間體從而形成1-（4-羥基-3-甲氧基苯基）-乙醇和香草酮。另外，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚也可以轉化為4-乙基愈創(chuàng)木酚、香草醛、香草酸和原兒茶酸。

在途徑2中提出了阿魏酸可以利用腸桿菌（Enterobacter soli）形成4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，此外也產生了少量的香草醛、香蘭醇和香草酸[11]。在途徑3中，鏈霉菌（Streptomyces setonii）ATCC 39116在測試培養(yǎng)基中對阿魏酸進行生物轉化后產生了4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（物質的量產率為111%）、香草醛、香草酸、香草醇和原兒茶酸[12]。在途徑4中，凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）BK07可在7 h內將阿魏酸催化為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，與途徑3相比，此途徑的不同之處在于香草醛未氧化為香草醇[13]。在途徑5中，黑曲霉（Aspergillus niger）DAR2的二倍體菌株與途徑4中凝結芽孢桿菌BK07降解阿魏酸的途徑相同，但是將其再培養(yǎng)120 h后香草醛會被氧化成香草酮和香草醇[14]。在途徑6中，費氏乳桿菌（Lactobacillus farciminis）將阿魏酸轉化為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚作為唯一的代謝產物，摩爾產率為26.50%。然而，在途徑7中，白腐真菌在24 h內將阿魏酸降解為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚作為主要的代謝產物，將其進一步培養(yǎng)24 h則會導致少量香草醛、香草酮和香草酸的產生[15]。

例如，在學習關于重量的內容時，我就帶了兩袋食鹽和一袋洗衣粉，另外還有硬幣，其中食鹽的袋子上標注著500克，洗衣粉的袋子上標注著1000克，而硬幣上面沒有標注。通過觀察實物，學生就能夠對重量有一個大概的認識，并且對重量單位也有了基本的了解。又如，在教學“周長”相關內容時，我讓學生量一量黑板、課桌、書本的長和寬，然后計算，甚至可以在父母的幫助下量一量自己家里家具面的長和寬。

2.2 植物細胞培養(yǎng)法

許多天然香料成分主要來源于植物，植物細胞培養(yǎng)是一種使植物細胞在培養(yǎng)液中合成代謝產物從而獲取天然香氣化合物的技術。植物是許多天然香料成分的主要來源，植物細胞培養(yǎng)技術是隨著生物技術的發(fā)展而發(fā)展起來的一種使植物細胞在培養(yǎng)液中合成代謝產物的技術。

植物細胞培養(yǎng)法可以通過阿魏酸的生物催化脫羧反應而合成多種天然芳香化合物，如4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、3-硝基苯乙烯和呋喃。TAKEMOTO M等[16]利用懸浮培養(yǎng)的細胞制備4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，這些細胞是從煙草、胡蘿卜、野茶樹和長春花中分離出來的，當?shù)孜锓词桨⑽核峒尤爰毎麘腋∫褐羞M行植物細胞培養(yǎng)時，可以定量產出4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，其中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚在長春花發(fā)酵液中的轉化率為65%，煙草為50%，胡蘿卜為30%；在以野茶樹為原料的發(fā)酵液中底物反式阿魏酸無法生物脫羧為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚。

細胞懸浮培養(yǎng)有培養(yǎng)條件不易控制、細胞位置不固定、難以形成愈傷組織和極易發(fā)生污染等缺點[17]，所以目標產物4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的產量不高，這可通過細胞固定化培養(yǎng)加以改善，提高4-乙烯基愈創(chuàng)木酚產量。

2.3 酶法

所有的生物代謝反應都是酶促反應。盡管上述幾種方法的作用機理尚不完全清晰，但可以確定它們都是由一種或幾種酶引起的。如能分離得到這些酶，利用酶促反應，則可更直接高效地生產4-乙烯基愈創(chuàng)木酚。目前國內外的研究狀況如表1所示。

酶促反應制備天然香氣化合物最重要的優(yōu)點是，副產物較少，底物的可選擇性高，反應條件簡單溫和，從而可以一步生成對應體化合物。但在一定程度上，利用酶法生產4-乙烯基愈創(chuàng)木酚容易受到底物濃度、酶活性和穩(wěn)定性的影響，所以如何優(yōu)化底物濃度以及利用生物手段和酶學知識對酚酸脫羧酶進行純化、定向改造，研究其改造固定化技術從而增加酶的穩(wěn)定性，是人們運用酶法生產4-乙烯基愈創(chuàng)木酚將要面臨的主要工作。

表1 酶法生產4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的國內外研究情況Table 1 Research progress of enzymatic production of 4-vinylguaiacol at home and abroad

3 發(fā)酵食品中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的作用

3.1 白酒

白酒的香味化合物十分復雜，種類繁多，其中揮發(fā)性酚類化合物是白酒中的重要香味組成部分，對于白酒的香氣、口感及穩(wěn)定性等方面均有著重要的作用[23]。4-乙烯基愈創(chuàng)木酚在白酒中的含量極少，但呈香作用卻很強，僅幾千分之一就能使人感覺到其特有的香氣。4-乙烯基愈創(chuàng)木酚是白酒中常見的呈香和呈味化合物，且風味活性較高。其香味閾值為209.30 μg/L[24]，對白酒整體貢獻水果香、花香和甜香。

崔利[25]在研究形成醬香型白酒風格屬性的關鍵工藝時，發(fā)現(xiàn)在高溫制曲的過程中，阿魏酸與植物細胞壁相連接的酯鍵斷裂從而釋放阿魏酸，在曲霉、酵母等微生物的作用下生成4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、香草醛和香草酸等酚類化合物，其中4-乙基愈創(chuàng)木酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚賦予醬香型白酒特有的甜香、花香和煙熏風味。柳軍[26]研究表明，在口子窖酒中，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚具有最大的香氣強度值（Intensity＞3.50），呈中藥氣味，其次是4-乙基愈創(chuàng)木酚和香草醛（Intensity＞3.00）。由香氣強度值可知，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和香蘭素對口子窖酒整體香氣貢獻較大，主要賦予口子窖酒藥香與甜香，使其醇香宜人。楊玉波等[27]對茅臺酒的香氣成分進行了分析，并結合風味成分氣味活性值（odor activity values，OAV）值分析發(fā)現(xiàn)苯乙醛、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和愈創(chuàng)木酚3 種化合物的OAV值均＞1，從而明確4-乙烯基愈創(chuàng)木酚是焦糖香的關鍵化合物，苯乙醛主要貢獻了甜香和花香特征。

3.2 啤酒

在啤酒生產過程中，小麥麥殼中的阿魏酸進行酶促或熱分解產生4-乙烯基愈創(chuàng)木酚，雖然啤酒中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚感官閾值很低僅為0.3 mg/L，但它的存在可以賦予啤酒辛辣、煙熏和丁香般的風味[28]。在大多數(shù)下面發(fā)酵啤酒中，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的風味被認為是不可取的，因而被稱為是酚類異味，所以這些啤酒中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的存在可作為啤酒廠中野生酵母或細菌污染的指標。盡管它在下面發(fā)酵啤酒中是異味物質，但4-乙烯基愈創(chuàng)木酚卻是形成比利時啤酒、德國維岑啤酒和勞赫啤酒等上面發(fā)酵啤酒香氣的必需成分。

COGHE S等[29]研究上面發(fā)酵啤酒時指出，酚類化合物是構成上面發(fā)酵小麥啤酒特有風味屬性的重要物質，而其中的4-乙烯基愈創(chuàng)木酚（4-vinylguaiacol，4VG）和4-乙烯基苯酚（4-vinylphenol，4VP）起著關鍵作用，它們分別具有木質香和刺激的酸味。上述兩種風味物質存在于釀造麥芽中，經(jīng)過制麥和糖化等工序進入啤酒中。其中4VG 是影響成品酒香氣形成的關鍵組分，4VP 是成品酒風味中不可缺少的組分。根據(jù)成東東[30]的實驗數(shù)據(jù)表明，比利時和德國小麥啤酒中都含有相對較高的4VG和4VP，其中，比利時小麥啤酒中4VG、4VP含量分別為3.251 mg/L和1.268 mg/L，德國小麥啤酒中4VG、4VP含量分別為3.690 mg/L和1.572 mg/L，這與在成品小麥啤酒的感官品評中德國小麥啤酒的酚香味稍濃于比利時小麥啤酒的結果是吻合的。

3.3 葡萄酒

隨著葡萄酒化學學科的形成和發(fā)展，葡萄酒品質的分析集中在其香氣和風味物質上，葡萄酒的香氣質量是影響葡萄酒品質和消費者購買意向的主要因素。在葡萄酒的感官方面，羥基肉桂酸對葡萄酒的風味影響不大，但其衍生物如4-乙烯基苯酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚對葡萄酒的風味產生有很大的影響[31]。這些揮發(fā)性酚的感官閾值較低，對葡萄酒的風味形成具有促進作用。但是超過一定濃度（極限閾值=725 μg/L乙烯基苯酚混合物，即4-乙烯基愈創(chuàng)木酚∶4-乙烯基苯酚=1∶1），可使葡萄酒帶有動物皮革、馬廄或馬汗的味道，嚴重影響酒的風味[32]。RAPP A[33]研究認為，當乙烯基苯酚混合物的閾值＞800 μg/L時，葡萄酒會出現(xiàn)塑料和繃帶等異嗅。

研究發(fā)現(xiàn)，羥基肉桂酸通過羥基苯乙烯脫羧酶轉化為其乙烯衍生物，然后經(jīng)還原酶還原為乙基衍生物[34]，前人研究報道釀酒酵母可以通過非氧化脫羧作用將葡萄酒中的對香豆酸和阿魏酸轉化為相應的乙烯基酚，其中葡萄酒內4-乙烯基苯酚、4-乙烯基愈木創(chuàng)酚的含量為0～2.8 g/L[35]。因此，對于釀酒師來說，控制葡萄酒中這些揮發(fā)性酚類化合物的濃度非常重要。

3.4 醬油

醬油是一種傳統(tǒng)的發(fā)酵調味品，香氣是醬油風味的重要品質特征，許多研究表明酚類物質是醬油醬香味的主要來源，雖然它們的含量不高，但具有相對較高的氣味活度值，因此對醬油的風味特性（如濃郁的醬香香氣）具有決定性作用[36]。醬油原料中的木質素經(jīng)米曲霉作用斷裂酯鍵釋放出阿魏酸，然后在酵母菌的作用下形成酚類物質，其中在醬油中具有代表性的酚類成分是4-乙烯基愈創(chuàng)木酚和4-乙基愈創(chuàng)木酚，它們的香氣特征十分強烈且活性明顯，賦予醬油丁香香味和煙熏的香氣，于整體風味感管至關重要。醬油中含有微量的4VG和4-EG就可以明顯提高醬油的風味[37]。

劉巍等[38]利用同時蒸餾萃取和固相微萃取技術分析醬油中揮發(fā)性組分時發(fā)現(xiàn)，對醬油香氣成分貢獻最大的是4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、4-羥基-2（5）-乙基-5（2）-甲基-3（2H）呋喃酮（4-hydroxy-2（5）-ethyl-5（2）-methyl-3（2H）furanone，HEMF）、乙醇、2,3-丁二醇以及3-甲硫基丙醇。并且指出4-乙烯基愈創(chuàng)木酚具有特征的醬香和煙熏香，且香氣活性強，對醬油風味貢獻較大，而使得風味更加豐滿，是提高香氣特征的關鍵，同時它也具有中和調節(jié)醬油中鹽分的呈味作用。李楊等[39]對醬油的香氣成分進行了分析，并結合OAV值確定了醬油中主要的香氣物質為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、1-辛烯-3-醇、苯乙醛和乙酸。其中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚在所有醬油樣品中均檢出，并且含量相對較高，平均香氣活性值達到3.4，能為醬油貢獻煙熏香氣。

4 展望

隨著4-乙烯基愈創(chuàng)木酚應用范圍的逐步擴大，其市場價值、產品性質和合成方法越來越受到人們的關注。利用生物合成法制備4-乙烯基愈創(chuàng)木酚是一項新興的技術，以其成本低、污染小、天然性和安全性高等優(yōu)點越來越廣泛的應用于食品行業(yè)，雖然生物合成法生產天然4-乙烯基愈創(chuàng)木酚正處在初步的探索階段，但是無疑具有廣闊的發(fā)展前景。

目前4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的生物合成法研究已經(jīng)取得一些實質性進步，但要真正實現(xiàn)工業(yè)化生產，逐步提高4-乙烯基愈創(chuàng)木酚等風味物質的含量，以全面提升白酒、啤酒、葡萄酒和醬油等傳統(tǒng)發(fā)酵食品的質量，還需進一步解決如下問題：闡明4-乙烯基愈創(chuàng)木酚的形成途徑及代謝機理，篩選出產4-乙烯基愈創(chuàng)木酚較高的微生物，植物細胞培養(yǎng)技術、酶分離提純技術以及生物合成方法的建立與完善。