槲皮素通過靶向GAS5/Notch1信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡的研究

蔣多晨，金 樂，陳洪曉，張 蕾，陳昭琳，居 靖

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬安慶醫(yī)院，安徽 安慶 246003；2.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)藥劑科，安徽 合肥 230001)

作為僅次于肺癌的最常被診斷出的癌癥，乳腺癌也是全球范圍內(nèi)女性癌癥死亡的主要原因[1]。近幾年乳腺癌發(fā)病率在國內(nèi)正在迅速增長且已位列首位，逐年加重[2]。手術(shù)治療、放療、化療、內(nèi)分泌治療和靶向治療，這些都是目前臨床乳腺癌治療的有效手段。其中，化療在乳腺癌的治療過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。除了一些傳統(tǒng)的化療藥物外，近年來對于中藥的抗癌研究逐漸受到研究者的重視。作為一種天然的小分子黃酮類化合物，槲皮素具有抗炎、抗氧化等多種藥理學(xué)作用,其抗癌作用日益受到關(guān)注，然而其抗腫瘤的分子機(jī)制尚未完全明確[3]。

近年來，大量非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)不僅改變了研究者對癌癥病理生理的認(rèn)識(shí)，也為癌癥治療開辟了新的前景。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，lncRNA) 是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200個(gè)堿基的RNA，不編碼蛋白質(zhì)，利用轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后修飾等途徑在基因表達(dá)中起關(guān)鍵調(diào)控作用，進(jìn)而參與多種生理和病理途徑的調(diào)節(jié)[4]。越來越多的證據(jù)表明，一些lncRNAs在多種癌癥(包括乳腺癌)細(xì)胞和組織中異常表達(dá)，可為惡性腫瘤分子診斷和治療提供靶點(diǎn)和依據(jù)[5]。作為一種腫瘤抑制因子，GAS5在乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)并有望成為乳腺癌潛在的治療靶點(diǎn)或預(yù)后預(yù)測因子。近年來發(fā)現(xiàn)，藥物通過調(diào)控GAS5起到抗腫瘤作用的研究嶄露頭角，這些研究為探究槲皮素的抗乳腺癌作用機(jī)制提供了新的思路[6-7]。

Notch1信號(hào)通路涉及多個(gè)細(xì)胞過程，例如增殖、分化、凋亡，細(xì)胞命運(yùn)決定和干細(xì)胞維持。除此之外，它在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用也不容忽視[8]。有研究顯示，GAS5可通過調(diào)控Notch1信號(hào)通路影響疾病進(jìn)程，這些研究為我們深入探索乳腺癌中GAS5與Notch1信號(hào)通路的相關(guān)性提供了有力的參考依據(jù)[9-10]。

本研究旨在初步探討槲皮素是否通過影響GAS5來調(diào)控Notch1信號(hào)通路從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡，為乳腺癌分子診斷和靶向治療開拓更多可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7由中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)朱濤教授課題組饋贈(zèng)。

1.1.2藥物與試劑 槲皮素(Quercetin,Q)，Sigma(貨號(hào)：Q4951-10G)；MTT試劑、DMSO試劑和姬姆薩原液，Solarbio(貨號(hào)：298-93-1、D8370、G1015)；血清、胰酶和RPMI 1640培養(yǎng)基，BI(貨號(hào)：04-001-1ACS、03-050-1ACS、01-100-1ACS)；Opti-MEM，Gibco(貨號(hào)：31985-070)；引物序列，上海生物工程公司；小干擾RNA，上海吉瑪基因公司；TRIzol Reagent和LipofectamineTM2000，Invitrogen(貨號(hào)：15596026、11668-019)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和q RT-PCR試劑盒，TaKaRa(貨號(hào)：RR047A、RR820A)；Notch1、Jagged1、Hes1單克隆抗體，Cell Signaling Technology(貨號(hào)：3608、70109、11988)；Caspase3單克隆抗體，Bioss(貨號(hào)：bs-0081R)；Bcl-2、Bax單克隆抗體，BOSTER(貨號(hào)：BA0412、BA0315-2)；β-actin單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/鼠二抗，中杉金橋(貨號(hào)：TA-09、ZB-2301、ZB-2305)；Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒，BD(貨號(hào)：556547)；BCA試劑盒、一抗稀釋液和DEPC無酶水，碧云天(貨號(hào)：P0010S、P0023A 、R0021)。

1.1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱(Heal Force)；流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)；ScanDrop2超微量核酸蛋白測定儀(Analytikjena)；Thermal Cycler PCR儀(天隆)；Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(賽默飛)；化學(xué)發(fā)光成像儀(培清)，酶標(biāo)儀(Molecular Devices)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%雙抗)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞處于對數(shù)生長期開始后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染 6孔板接種對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞,待細(xì)胞密度達(dá)40%-60%，將3條GAS5小干擾RNA序列(siGAS5#1,siGAS5#2,siGAS5#3)及其陰性對照的小干擾RNA序列(sncRNA)，分別與LipofectamineTM2000混合孵育后加入各孔中(siRNA終濃度約為0.66 mg·L-1)。培養(yǎng)6 h后分別換成含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基和槲皮素藥液(80 μmol·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)48 h。小干擾RNA序列如下所示：siGAS5#1：正義鏈5′-GGCUCUGGAU AGCACCUUATT-3′,反義鏈5′-UAAGGUGCUAUCC AGAGCCTT-3′;siGAS5#2：正義鏈5′-GCAAAGG ACUCAGAAUUCATT-3′,反義鏈5′-UGAAUUCUG AGUCCUUUGCTT-3′;siGAS5#3：正義鏈5′-GCAU GCAGCUUACUGCUUGTT-3′,反義鏈5′-CAAGCAG UAAGCUGCAUGCTT-3′;sncRNA ：正義鏈5′-UUC UCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反義鏈5′-ACGUGAC ACGUUCGGAGAATT-3′。

1.2.3MTT法檢測槲皮素對MCF-7細(xì)胞活力的影響 96孔板接種對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞，加入100 μL不同濃度的槲皮素(5、10、20、40、80、160 和320 μmol·L-1)，空白組和對照組加入等量培養(yǎng)基，作用24、48和72 h后，每孔加入100 μL MTT工作液，避光孵育4 h，吸去MTT，每孔加入150 μL DMSO，暗處慢搖，OD值用酶標(biāo)儀在490 nm處測出。數(shù)據(jù)處理的公式為細(xì)胞活力/%=(藥物組OD值-空白組OD值/對照組OD值-空白組OD值)×100%。

1.2.4平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測槲皮素對MCF-7細(xì)胞增殖克隆能力的影響 6孔板接種對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞,加入不同濃度的槲皮素(40、80、160 μmol·L-1)，處理24 h后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每3 d換液1次，并觀察細(xì)胞克隆增殖情況。待6孔板中已形成足夠菌落，無水乙醇固定，姬姆薩染液染色后，棄除染液，用自來水洗掉殘余染液，自然晾干后，在顯微鏡下觀察并用相機(jī)拍照。最后對每組的克隆細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行計(jì)算。

1.2.5Annexin V-FITC/PI法檢測槲皮素對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 6孔板接種對數(shù)生長期MCF-7細(xì)胞,加入不同濃度的槲皮素(40、80、160 μmol·L-1),處理48 h后收集細(xì)胞。加入冷PBS洗2次后用100 μL Binding buffer制細(xì)胞懸液，依次加入Annexin V-FITC和PI染色液各5 μL。室溫避光孵育15 min。加入400 μL Binding buffer混懸細(xì)胞后上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.6qRT-PCR法檢測GAS5、Notch1信號(hào)通路以及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，分別采用不同濃度槲皮素(40、80、160 μmol·L-1)、GAS5小干擾RNA(siGAS5#1，siGAS5#2，siGAS5#3)、槲皮素協(xié)同siGAS5#1處理24或48 h后，用TRIzol分別提取細(xì)胞總RNA，采用ScanDrop2超微量核酸蛋白測定儀將總RNA進(jìn)行定量后，每組各取500 ng總RNA用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR反應(yīng)程序按以下條件進(jìn)行:95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)。采用相對定量法，以β-actin作為內(nèi)參，將各Ct值代入公式2-△△Ct，比較各組的RNA相對表達(dá)量。所用引物序列如下所示:β-actin上游:5′-GCCAACACAGTGCT GTCTGG-3′，下游:5′-CTCAGGAGGAGCAATGATCT TG-3′；GAS5上游:5′-CCTGTGAGGTATGGTGCTGG-3′，下游:5′-CTGTGTGCCAATGGCTTGAG-3′；Notch1上游:5′-GAATGGCGGGAAGTGTGAAGC-3′，下游:5′-TAGTCTGCCACGCCTCTGC-3′；Jagged1上游:5′-CCTGGGCTTTGAGTGTGAGTGTTC-3′,下游:5′-GTC GCAGTAGTAGCTGGCAATGAG-3′；Hes1上游:5′-AAGTGTGCTGGGGAAGTACC-3′，下游:5′- GGGG TAGGTCATGGCATTGAT-3′；Bcl-2上游:5′-GGGTC ATGTGTGTGGAGAG-3′,下游:5′-AGCCAGGAGA AATCAAACAG-3′；Bax上游:5′-GAACTGGACAAC AACATGGA-3′，下游:5′-GCAAAGTAGAAAAGGG CAAC-3′；Caspase3上游:5′-TGTCTTCTGTAATCGCC AAG-3′，下游:5′-CCGTTCGTTCCAAAAATTAC-3′。

1.2.7Western blot檢測Notch1信號(hào)通路以及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中，分別采用不同濃度槲皮素(40、80、160 μmol·L-1)、siGAS5#1、槲皮素協(xié)同siGAS5#1處理48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，BCA 定量法定量后制備8%聚丙烯酰胺凝膠，每孔20 μg上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后，恒壓轉(zhuǎn)膜，使蛋白由膠轉(zhuǎn)至PVDF膜，之后浸入封閉劑(5%脫脂牛奶)中室溫封閉2 h，TBST洗滌后，加一抗(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗滌后加入二抗(1 ∶10 000)，常溫孵育2 h。膜經(jīng)TBST 洗滌后ECL顯色，曝光成像。最后通過ImageJ軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對MCF-7細(xì)胞活力的抑制作用MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，槲皮素作用24、48和72 h后均可抑制MCF-7細(xì)胞活力，并且作用時(shí)間越長抑制作用越強(qiáng)，呈時(shí)間依賴性。同時(shí)，與對照組相比，槲皮素濃度為40、80和160 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞活力明顯受到抑制，如Fig 1所示。隨著藥物濃度的增大，細(xì)胞活力逐漸降低，呈現(xiàn)濃度依賴性。因此我們將采用抑制效果較佳的40、80和160 μmol·L-1的槲皮素濃度組作用48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 槲皮素對MCF-7細(xì)胞增殖克隆能力的抑制作用如Fig 2所示，與對照組相比，隨著槲皮素濃度增大，細(xì)胞菌落變小，細(xì)胞克隆數(shù)量降低(P<0.01)，說明槲皮素可明顯抑制MCF-7細(xì)胞的增殖克隆能力且呈濃度依賴性。

2.3 槲皮素誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，不同濃度槲皮素(40、80、160 μmol·L-1)處理48 h后，其各濃度組均能在一定程度上誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。與對照組相比，槲皮素處理組(80、160 μmol·L-1)的細(xì)胞凋亡率普遍增高(Fig 3)。qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明,槲皮素各濃度組均能不同程度地增加MCF-7細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase3 mRNA和蛋白表達(dá)水平，而降低Bcl-2的mRNA(Fig 4A)和蛋白(Fig 4B)表達(dá)水平。

2.4 槲皮素促進(jìn)MCF-7細(xì)胞中GAS5的表達(dá)如Fig 5A所示，80、160 μmol·L-1槲皮素處理后，GAS5表達(dá)較對照組明顯升高，提示槲皮素可明顯促進(jìn)MCF-7細(xì)胞中GAS5的表達(dá)。

Fig 1 Effect of quercetin on viability of MCF-7 cells at 24,48 and 72 A:24 h.B:48 h.C:72 h.*P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 2 Effect of quercetin on cell colonies of MCF-7 A:The colony-forming ability was measured by a colony-forming assay.B:Quantitative analysis showed the number of colonies of MCF-7 cells.**P<0.01 vs control group

2.5 槲皮素對MCF-7細(xì)胞中Notch1信號(hào)通路的影響與對照組相比，不同濃度槲皮素(40、80、160 μmol·L-1)處理MCF-7細(xì)胞后，Notch1信號(hào)通路中的相關(guān)蛋白Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA(Fig 4C)和蛋白(Fig 4D)表達(dá)水平均不同程度地下調(diào)，提示槲皮素可明顯抑制MCF-7細(xì)胞中Notch1信號(hào)通路的激活。

2.6 槲皮素通過靶向GAS5/Notch1信號(hào)通路促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡如Fig 5B所示，與sncRNA組相比較，三條siGAS5序列中siGAS5#1具有更優(yōu)的沉默效率，因此選擇用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。在MCF-7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染siGAS5#1后，發(fā)現(xiàn)Notch1信號(hào)通路的相關(guān)蛋白Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA(Fig6C)和蛋白(Fig 6D)表達(dá)水平較其sncRNA組升高,而凋亡相關(guān)蛋白Bax和Caspase3 mRNA和蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高(Fig 6A和Fig 6B)。更有趣的是，當(dāng)用siGAS5#1與槲皮素(80 μmol·L-1)共處理48 h后，我們發(fā)現(xiàn)，與Q+sncRNA組相比，GAS5表達(dá)明顯下調(diào)(Fig5C)，而Notch1信號(hào)通路的相關(guān)蛋白Notch1、Jagged1、Hes1以及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的蛋白表達(dá)水平明顯升高,Bax和Caspase3的蛋白表達(dá)水平降低(Fig 7D和Fig 7B)，與其mRNA表達(dá)水平相似(Fig7C和Fig 7A)。這些結(jié)果提示槲皮素可通過靶向GAS5來調(diào)控MCF-7細(xì)胞中Notch1信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。

Fig 3 Effect of quercetin on apoptosis of MCF-7 A:MCF-7 cell apoptosis was detected by the Annexin V-FITC/PI double staining assay.B:Quantitative analysis showed the apoptotic rate of each group of MCF-7 cells.*P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 4 Effect of quercetin on expression levels of Notch1,Jagged1,Hes1,Bcl-2,Bax and A and C:The Notch1,Jagged1,Hes1,Bcl-2,Bax and Caspase-3 mRNA expressions were examined by qRT-PCR.B and D:The Notch1,Jagged1,Hes1,Bcl-2,Bax and Caspase-3 protein expressions were examined by Western blot.*P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 5 Effects of quercetin and siRNAs on GAS5 expression level in MCF-7 A:The expression of GAS5 in MCF-7 cells treated with quercetin was examined by qRT-PCR.B and C:MCF-7 cells were transfected with siRNAs and co-treated with quercetin(80 μmol·L-1).The GAS5 expression was examined by qRT-PCR.*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05 vs sncRNA group or Q+sncRNA group.

Fig 6 Effect of silencing GAS5 on expression levels of Notch1,Jagged1,Hes1,Bcl-2,Bax and A and C:The Notch1,Jagged1,Hes1,Bcl-2,Bax and Caspase-3 mRNA expressions were detected by qRT-PCR.B and D:The Notch1,Jagged1,Hes1,Bcl-2,Bax and Caspase-3 protein expressions were detected by Western blot.#P<0.05 vs sncRNA group.

Fig 7 Effects of GAS5 silence and co-treatment with quercetin(80 μmol·L-1) on expression levels of Notch1,Jagged1,Hes1,Bcl-2,Bax and A and C:The Notch1,Jagged1,Hes1,Bcl-2,Bax and Caspase-3 mRNA expressions were examined by qRT-PCR.B and D:The Notch1,Jagged1,Hes1,Bcl-2,Bax and Caspase 3 protein expressions were examined by Western blot.*P<0.05,**P<0.01 vs control group;#P<0.05 vs Q+sncRNA group.

3 討論

乳腺癌一直以來因其惡性程度高、預(yù)后不良和復(fù)發(fā)率高等特點(diǎn)成為女性死亡率較高的癌癥[1]。近年來，中藥在腫瘤治療包括乳腺癌治療中因其療效優(yōu)和副作用小等特點(diǎn)贏得人們越來越多的關(guān)注。然而其潛在的抗癌機(jī)制仍不明確，需要更多的研究者們繼續(xù)深入探究。槲皮素屬于黃酮醇類化合物，可抗菌、抗炎、抗過敏、抗氧化以及降血壓，還能有效發(fā)揮防癌抑癌作用[3]。因此，對槲皮素抗癌分子機(jī)制的深入研究將為乳腺癌的防治提供理論依據(jù)。目前已有的研究指出槲皮素通過上調(diào)miR-146a抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[11]。本研究中的MTT、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)以及Western blot結(jié)果均顯示槲皮素對乳腺癌細(xì)胞的抑制增殖和促凋亡作用。

近年來，越來越多的lncRNAs不僅被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中表達(dá)異常，而且對腫瘤進(jìn)程的影響頗深。GAS5(生長阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5)屬于長鏈非編碼RNA，位于人類基因組1號(hào)染色體上，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)[12]。作為一種抑癌基因，GAS5可通過影響多種基因組轉(zhuǎn)錄和信號(hào)傳導(dǎo)途徑而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和耐藥性。已有研究顯示，GAS5通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制結(jié)直腸癌的血管生成和轉(zhuǎn)移[13]；GAS5通過調(diào)控PTEN表達(dá)影響肝癌細(xì)胞增殖和耐藥性[14]。Mourtada-Maarabouni等[15]研究首次報(bào)道，乳腺癌組織中GAS5轉(zhuǎn)錄水平顯著降低且發(fā)現(xiàn)GAS5在乳腺癌中被下調(diào)，其低表達(dá)水平表明乳腺癌患者的預(yù)后不良。有關(guān)GAS5在乳腺癌中的調(diào)控作用和機(jī)制也被報(bào)道，例如Zheng等[16]研究指出，GAS5可通過靶向miR-378a-5p/SUFU信號(hào)促進(jìn)三陰性乳腺癌細(xì)胞的凋亡；同樣，我們課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，GAS5/miR-221-3p/DKK2軸可通過Wnt/β-Catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞對ABCB1介導(dǎo)的阿霉素耐藥性[17]。這提示我們GAS5將成為一個(gè)有潛力的乳腺癌治療靶點(diǎn)。

近年來，有關(guān)中藥調(diào)控GAS5的癌癥研究層出不窮。Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中藥補(bǔ)骨脂寧可通過靶向GAS5從而抑制肝癌細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展；姜黃素通過抑制致癌的MAPK和PI3K/PKB信號(hào)通路上調(diào)GAS5，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡[7]。這些研究為我們的實(shí)驗(yàn)奠定了良好的理論基礎(chǔ)并提供了一個(gè)新思路。有趣的是，本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)槲皮素可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞中GAS5的表達(dá)。

Notch1是一種跨膜蛋白，可作為配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。配體-受體相互作用引起Notch1細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的切割，使胞內(nèi)的Notch1(ICN1，Notch1的活化形式)從膜中釋放并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，從而促進(jìn)其下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。Notch1通路是一種重要的促癌信號(hào)通路，在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)。Hu等[18]研究揭示，馬錢子堿通過抑制Jagged1/Notch1信號(hào)通路激活來抑制乳腺癌細(xì)胞骨轉(zhuǎn)移。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明了槲皮素不僅能在mRNA水平，而且可在蛋白水平上均抑制Notch1信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，驗(yàn)證了槲皮素對Notch1信號(hào)通路的抑制作用。此外，目前已有研究指出GAS5與Notch1之間的強(qiáng)相關(guān)性并且表明GAS5可通過調(diào)控Notch1信號(hào)通路調(diào)節(jié)疾病的發(fā)生發(fā)展。Chen等[9]研究發(fā)現(xiàn)，GAS5作為與miR-137競爭的內(nèi)源性RNA通過調(diào)控Notch1信號(hào)通路從而調(diào)節(jié)缺血性卒中；Zhao等[10]研究指出，GAS5敲低抑制腦梗死大鼠神經(jīng)元凋亡可能與Notch1信號(hào)通路的激活有關(guān)。這些研究讓我們產(chǎn)生了新的思考，槲皮素是否能通過靶向GAS5而阻止Notch1促癌信號(hào)通路的激活，從而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。我們通過沉默GAS5與槲皮素共處理后發(fā)現(xiàn)GAS5與Notch1信號(hào)通路之間的強(qiáng)相關(guān)性，進(jìn)一步證明槲皮素是通過靶向GAS5/Notch1信號(hào)通路從而促使乳腺癌細(xì)胞的凋亡。不足的是，本文研究尚未開展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。因此我們課題組后續(xù)將采用裸鼠乳腺癌移植瘤模型進(jìn)行相關(guān)研究，以探索和完善槲皮素在體內(nèi)的作用及其機(jī)制。

綜上所述，本研究證實(shí)了槲皮素抑制人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，并表明了槲皮素可通過靶向GAS5/Notch1信號(hào)通路發(fā)揮其抑癌作用。這對乳腺癌的早期診斷、預(yù)后和治療具有參考價(jià)值，為乳腺癌的臨床用藥開拓了新的治療方案思路，但其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步驗(yàn)證與闡明。