基于阿爾茨海默癥神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生所致炎癥反應(yīng)的研究

祝紹峰，侯翌葳，孫陽，席思婕，孫劍明，姚宏波

齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006

阿爾茲海默病是指患者伴有認(rèn)知功能減退、 人格及行為障礙為特征表現(xiàn)一類神經(jīng)系統(tǒng)病變疾病， 對其病理改變?yōu)槟X內(nèi)β 淀粉樣蛋白沉積后形成老年斑，tau 蛋白過度磷酸化后形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)、神經(jīng)元缺失[1]。 目前對發(fā)病機制尚不明確，經(jīng)知曉其發(fā)病機制包括以下幾類：Aβ沉積學(xué)說、遺傳學(xué)因素及中樞膽堿能損傷學(xué)說等。 研究指出[2]，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能異常變化，同樣與阿爾茲海默病病理生理密切相關(guān)。 大量尸檢結(jié)果表明[3]，阿爾茲海默病患者中合并嚴(yán)重局灶性炎癥反應(yīng)， 皮質(zhì)及神經(jīng)炎性斑中發(fā)現(xiàn)大量活化小膠質(zhì)細(xì)胞、 星型膠質(zhì)細(xì)胞及免疫反應(yīng)產(chǎn)物，正常人群中無上述反應(yīng)。 為此，2019 年7 月—2020 年1 月該實驗選取16 只實驗小鼠證實阿爾茲海默病與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與炎癥之間關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗選取雄性小鼠16 只，隨機分為兩組，各8 只。 年齡范圍10~12 周，體質(zhì)量264~310 g，平均（284.2±14.4）g。均為SPF 級，購自北京華阜康生物技術(shù)科技有限公司（動物合格證號0284311）。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物處理將16 只小鼠分籠飼養(yǎng)，自然光照，標(biāo)準(zhǔn)喂養(yǎng)，所有小鼠均標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)7 d，對模型組小鼠，可雙側(cè)海馬注射5 μL 凝膠態(tài)Aβ25~35，對照組小鼠，雙側(cè)位置注射5 μL 生理鹽水。 動物癡呆模型制作：對小鼠腹腔內(nèi)，可注射4%水合氯醛溶液1 mL/100 g，當(dāng)麻醉后，將小鼠固定至腦立體定位儀上， 同時， 要求參考小鼠立體定位圖譜，并對海馬CA1 區(qū)定位，依據(jù)實驗標(biāo)準(zhǔn)，并確定進(jìn)針點并進(jìn)針，位置上：前囟后3.50 mm，中縫左或右±2.00 mm，緩慢對顱骨腦硬膜平面注射2.7 mm，予以微量注射器，緩慢向雙側(cè)海馬注入Aβ25~35，留針5 min，縫合傷口，術(shù)后予以青霉素抗炎。

1.2.2 生化檢查兩組小鼠均選取麻醉方式為水合氯醛（國藥準(zhǔn)字H34022125；規(guī)格5 mL），心臟內(nèi)取血，將其保存至室溫下30 min，4℃下，并以4 000 r/min 離心，經(jīng)10 min 后并取上清液，保存在低溫冰箱中。 酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測兩種炎性指標(biāo)，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β），嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。 取血后，予以左心室灌注250 mL 生理鹽水及含4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液，先快后慢，1 h 后并斷頭去腦部組織，沿著注射位置并切開冠狀面，將其分為左右半腦，予以4%多聚甲醛固定過夜，脫水、透明、浸蠟，朝下包埋兩塊腦部組織，冠狀切片，厚度為5 um，并染色開展免疫組化。硫堇染色法：沿著中間位置切開石蠟標(biāo)本，并連續(xù)切片，后每隔4 張，抽取一張并予以二甲苯脫蠟，后梯度乙醇水合，蒸餾水進(jìn)行沖洗，0.2%硫堇60℃水浴30~60 min 后，經(jīng)冷卻后，并采取梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。 細(xì)胞計數(shù)法：抽取大腦皮層損傷程度最為嚴(yán)重小鼠，每組3 只，抽取2 張切片，并在光鏡下觀察，切片上，均予以2 個400 倍視野，開展神經(jīng)細(xì)胞技術(shù)。 予以免疫組織化學(xué)技術(shù)，對膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白質(zhì)表達(dá)檢測。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)， 計量資料以（±s）表示，組間比較采用t 檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠Aβ 下致阿爾茲海默下大腦皮層神經(jīng)元炎癥情況下數(shù)量比較

硫堇染色后，對照組中小鼠皮層中，神經(jīng)元表現(xiàn)上，以清晰、完整，突起明顯、膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量少。 模型組小鼠皮層中，神經(jīng)元表現(xiàn)上，呈現(xiàn)減少、斷裂及細(xì)胞不完整，此時以局部區(qū)域神經(jīng)元壞死為表現(xiàn)（圖1），模型組大腦皮層神經(jīng)元炎癥數(shù)量多于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組小鼠大腦皮層神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量比較[（±s），個]Table 1 Comparison of the number of glial cells in the cerebral cortex of the two groups of mice[（±s），pcs]

表1 兩組小鼠大腦皮層神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量比較[（±s），個]Table 1 Comparison of the number of glial cells in the cerebral cortex of the two groups of mice[（±s），pcs]

組別神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量模型組（n=8）對照組（n=8）t 值P 值516.65±24.26 105.65±14.26 41.310 0.001

2.2 兩組小鼠血清中TNF-α 和IL-1β 水平比較

模型組小鼠血清中TNF-α 和IL-1β 水平高于對照組，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組小鼠血清中TNF-α 和IL-1β 水平比較[(±s)，pg/mL]Table 2 Comparison of serum levels of TNF-α and IL-1β between the two groups of mice[(±s)，pg/mL]

表2 兩組小鼠血清中TNF-α 和IL-1β 水平比較[(±s)，pg/mL]Table 2 Comparison of serum levels of TNF-α and IL-1β between the two groups of mice[(±s)，pg/mL]

組別TNF-α IL-1β模型組（n=8）對照組（n=8）t 值P 值85.65±25.56 40.05±13.12 4.489 0.001 13.32±5.65 7.44±2.45 2.701 0.017

A 為模型組；B 為對照組A is the model group; B is the control group

3 討論

阿爾茲海默病患者， 因腦部伴有持續(xù)、 慢性炎癥反應(yīng)，此時參與炎性反應(yīng)細(xì)胞主要為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。 部分研究指出[4]，若長期服用非甾體類抗炎藥物，阿爾茲海默病發(fā)病率顯著降低， 炎癥反應(yīng)往往參與阿爾茲海默病發(fā)病過程。小膠質(zhì)細(xì)胞（MG）占據(jù)腦內(nèi)所有膠質(zhì)細(xì)胞5%~10%，其歸為腦內(nèi)單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)。 一般情況下，多處于靜息狀態(tài)，當(dāng)受到刺激后激活并吞噬、清除Aβ，從而降低Aβ 神經(jīng)毒性，但另一方面，上述過程中會產(chǎn)生大量生物活性物質(zhì)，伴隨著細(xì)胞表面受體上調(diào)及炎性因子高表達(dá)，引起神經(jīng)元凋亡、死亡，加速阿爾茨海默病進(jìn)程[5]。 星形膠質(zhì)細(xì)胞存在于阿爾茨海默病齒狀回、 海馬各區(qū)膠質(zhì)纖維酸性蛋白陽性星型膠質(zhì)細(xì)胞中，呈現(xiàn)上升趨勢。 動物模型研究表明[6]，當(dāng)星型膠質(zhì)細(xì)胞激活后，此時機體內(nèi)TNF-α過度表達(dá)后并產(chǎn)生慢性炎癥反應(yīng)， 引起一系列異常行為造成神經(jīng)退行性病變。 少突膠質(zhì)細(xì)胞作用可維持、保護(hù)神經(jīng)元正常功能，當(dāng)少突膠質(zhì)細(xì)胞異常時，并造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變，嚴(yán)重時引起神經(jīng)元損傷。

目前多數(shù)研究證實[7]，對阿爾茲海默病患者而言，激活膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增加，其表達(dá)與膠質(zhì)細(xì)胞活性為正比，此時膠質(zhì)細(xì)胞增生，則表明中樞神經(jīng)伴有一定程度損傷。 試驗結(jié)果得出， 模型組小鼠注射Aβ25~35 后并進(jìn)行硫堇染色，小鼠皮層神經(jīng)元少，突起減少、斷裂，細(xì)胞體表現(xiàn)不完整，局部區(qū)域神經(jīng)元死亡，結(jié)果表明，對阿爾茲海默病小鼠模型而言， 自身中樞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多并伴有神經(jīng)元損傷。 部分研究指出[8]，阿爾茲海默病患者腦內(nèi)老年斑周圍中，伴有大量活化神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及炎性因子，其疾病進(jìn)程情況往往與神經(jīng)退行性疾病病變聯(lián)系緊密， 且伴有持續(xù)慢性炎性反應(yīng)。 文章指出，模型組大腦皮層神經(jīng)元炎癥數(shù)量（516.65±24.26）個，多于對照組（105.65±14.26）個， 模型組TNF-α、IL-1β 分別為 （85.65±25.56）pg/mL、（13.32±5.65）pg/mL， 高 于 對 照 組 （40.05±13.12）pg/mL、（7.44±2.45）pg/mL(P＜0.05)。 研究表明[9]，另一項動物試驗中，通過對神經(jīng)損傷小鼠腦皮層神經(jīng)元炎癥數(shù)量、TNF-α、IL-1β 水平分別為（479.65±13.24）pg/mL、（84.42±21.25）pg/mL、（13.41±5.71）pg/mL 與 正 常 小 鼠 （104.56±13.78）pg/mL、（40.08±13.24）pg/mL、（7.51±2.51）pg/mL 對比顯著偏高，進(jìn)一步得出，神經(jīng)損傷會進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)，TNF-α 誘導(dǎo)神經(jīng)毒性， 激活膠質(zhì)細(xì)胞自分泌谷氨酸鹽試驗， 若機體TNF-α、IL-1β 水平進(jìn)一步上升，反應(yīng)癡呆嚴(yán)重程度，為一項輔助生物學(xué)診斷指標(biāo)。 血清中， 若處于高水平TNF-α?xí)r，神經(jīng)元自身伴有毒性作用，會協(xié)同IL-1 誘導(dǎo)，病程進(jìn)展速度加快[10]。 總結(jié)試驗觀點指出，阿爾茲海默病患者膠質(zhì)細(xì)胞激活，相對應(yīng)腦組織神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量上升，釋放炎癥因子并造成神經(jīng)元損傷。 因此，對臨床醫(yī)師而言，對阿爾茲海默病患者需及時予以抗炎藥物服用， 從而抑制腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，減緩病程進(jìn)展。 神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在阿爾茲海默病中扮演著重要角色， 小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞處于特定炎癥介質(zhì)調(diào)控下活化， 通過依賴性對中樞神經(jīng)系統(tǒng)加以調(diào)節(jié)造成損傷。 膠質(zhì)細(xì)胞所介導(dǎo)炎癥，與阿爾茲海默病相關(guān)病變進(jìn)展具有雙重性， 不同學(xué)者對其治療阿爾茲海默病途徑進(jìn)行研究中， 利用阿爾茲海默病相關(guān)動物模型開放及治療方式取得顯著成效[11]。目前對阿爾茲海默病疾病發(fā)病機制尚無完全定論， 僅知曉膠質(zhì)細(xì)胞參與疾病發(fā)病過程，對檢測診斷提供合理依據(jù)。 但由于阿爾茲海默病作為一類無法根治性疾病，因此，介于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞自身多功能特性， 將其作為對象進(jìn)行研究為阿爾茲海默病未來可發(fā)展新方向之一[12]。由于該次實驗僅開展小鼠實驗，且實驗?zāi)繕?biāo)數(shù)量、實驗室條件限制，會影響整體實驗數(shù)據(jù)，后續(xù)仍需加大樣本量進(jìn)一步證實論點。

綜上所述， 阿爾茲海默病中小鼠神經(jīng)元炎癥細(xì)胞數(shù)量顯著偏多， 膠質(zhì)細(xì)胞及促炎因子釋放會造成小鼠腦神經(jīng)元損傷。