山羊KLF6的分子克隆及其時(shí)空表達(dá)特征分析

王江林，王 永，孟慶勇，朱江江，林亞秋

(1.西南民族大學(xué)，青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部、四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué) 畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物學(xué)院，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

隨著羊肉在人們?nèi)馄废M(fèi)中占據(jù)越來越高的地位，人們對(duì)羊肉品質(zhì)的要求也達(dá)到了新的水平，影響肉質(zhì)性狀的重要因素是動(dòng)物體內(nèi)脂肪組織的分布，而前體脂肪細(xì)胞的分化是動(dòng)物脂肪沉積的主要方式。前體脂肪細(xì)胞的分化是一個(gè)多轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用的復(fù)雜生物過程[1]，伴隨著細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的變化，越來越多的研究表明，Krupprl樣因子家族(Kruppel-like factors，KLFs)能夠獨(dú)立或者協(xié)同其他轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控脂肪細(xì)胞分化[2-3]。研究KLFs基因?qū)χ炯?xì)胞分化的調(diào)控作用和闡明其影響山羊肉質(zhì)性狀的分子機(jī)制具有重要意義。

KLFs是一類在真核生物體內(nèi)廣泛分布的重要鋅指蛋白[3-5]，其功能復(fù)雜多樣。目前共發(fā)現(xiàn)KLFs家族成員有18個(gè)，成員間存在直接或間接相互作用，在不同的生物過程中都發(fā)揮重要調(diào)控功能[6-7]。已有研究證明KLFs家族有多個(gè)成員參與脂肪分化中，并發(fā)揮重要的作用[8-10]。KLF6是KLFs家族中的重要一員，最早從小鼠和人的肝臟星形間葉細(xì)胞和胎盤中獲得[11]，KLF6作為轉(zhuǎn)錄因子，可能通過結(jié)合基因的啟動(dòng)子來調(diào)控靶基因的表達(dá)[12]。近年在小鼠上研究表明，KLF6參與到前體脂肪細(xì)胞分化及脂質(zhì)代謝過程中[9]。Li等[10]在3T3-L1細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)KLF6可能通過抑制DLK1來促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，Bechmann等[13]研究發(fā)現(xiàn)KLF6增加了PPARα的活性，而敲除KLF6則抑制PPARα活性。其中PPARα是參與脂肪細(xì)胞分化過程的重要的核受體類轉(zhuǎn)錄因子[14]。以上研究皆暗示KLF6在脂肪細(xì)胞分化中具有重要的調(diào)控作用，然而KLF6在家畜中的相關(guān)報(bào)道較少，同時(shí)西南民族大學(xué)現(xiàn)代生物技術(shù)國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)KLF6是山羊脂肪細(xì)胞分化前后的主要差異基因之一。

本研究克隆得到簡州大耳羊KLF6核苷酸序列并利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real time PCR，qPCR)等技術(shù)明確該基因的組織和細(xì)胞時(shí)序表達(dá)模式，本研究結(jié)果為最終闡明其對(duì)山羊脂肪細(xì)胞分化的調(diào)控作用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與組織的采集 試驗(yàn)動(dòng)物選擇生長12月左右(n=4)健康簡州大耳羊，自四川省簡陽市大哥大牧業(yè)有限公司購得。清晨空腹屠宰后，當(dāng)即剪取心、肝、脾、肺、腎、背最長肌、股二頭肌、臂三頭肌、皮下脂肪、腹間脂肪、大腸、小腸、瘤胃、胰臟等組織樣品，將樣品在DEPC水中清洗后，快速用錫紙包好并分裝在標(biāo)好編號(hào)的凍存管內(nèi)置于液氮中保存。

1.1.2 試驗(yàn)材料 TRIzol試劑、pMD-19T Vector載體及SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)試劑盒通過TaKaRa公司訂購；通過Thermo公司購得反轉(zhuǎn)錄(Revert Aid First Strand cDNA SynthesisKit)試劑盒；DH5α感受態(tài)細(xì)胞與2×GC-rich PCR Master Mix通過北京天根生化科技有限公司購得；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit試劑盒通過Axygen公司購得；雙抗、PBS、胰蛋白酶及DEME/F12培養(yǎng)基通過Hyclone公司供售；胎牛血清通過Gemini公司購得；油酸通過Sigma公司購得；細(xì)胞培養(yǎng)皿等耗材由依科賽生物制品有限公司供售；氯仿、異丙醇、DEPC及其他試劑則為國產(chǎn)生化試劑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 按照TRIzol法提取各組織及細(xì)胞總RNA，檢測RNA完整性、RNA濃度及純度，利用紫外分光光度計(jì)測定OD值在1.8～2.0，符合試驗(yàn)要求。所提取RNA去除基因組DNA并參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 山羊KLF6基因的克隆測序 根據(jù)GenBank上登錄的山羊、綿羊、牛的KLF6基因預(yù)測序列，利用Primer Primer 5.0軟件在其序列比對(duì)保守區(qū)域，設(shè)計(jì)得到PCR特異性擴(kuò)增引物(表1)，引物由成都擎科(成都)生物公司合成，并以脂肪組織cDNA為

表1 引物信息Tab.1 Primers information

模板克隆KLF6基因PCR反應(yīng)體系為Tap PCR Master Mix(2×)12.5 μL、Primer F(10 μmoL/L)1.0 μL、Primer R(10 μmoL/L)1.0 μL、模板cDNA 1.0 μL，ddH2O 9.5 μL，反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測為所需目的條帶，并通過AxyPrep DNA Gel Extraction Kit試劑盒回收目的條帶，構(gòu)建PMD-19T-KLF6連接載體，并在DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化，37 ℃培養(yǎng)13～16 h，挑取陽性克隆，并進(jìn)行菌落PCR鑒定，最后送成都擎科(成都)公司進(jìn)行序列測定。

1.2.3 山羊KLF6基因生物信息學(xué)分析 利用NCBI 網(wǎng)站上ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析KLF6基因的開放閱讀框，通過Blast在線工具進(jìn)行同源性比較，利用MEGA 7軟件進(jìn)行KLF6基因物種進(jìn)化樹分析；利用ExPASY(http://www.expasy.org)分析推導(dǎo)蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)，利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預(yù)測跨膜結(jié)構(gòu)域，利用SignalP 4.1 Server預(yù)測信號(hào)肽序列，利用NetPhos 2.0、NetOGlyc 4.0、NetNGlyc 1.0分析預(yù)測KLF6蛋白磷酸化位點(diǎn)、O 糖基化位點(diǎn)、N 糖基化位點(diǎn)，通過PSORT II(http://psort.hgc.jp/)對(duì)亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測，相關(guān)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)由STRING(http://www.string-db.org/)交互式數(shù)據(jù)庫構(gòu)建，NPS預(yù)測二級(jí)結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL(http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.4 山羊KLF6基因組織表達(dá)檢測 根據(jù)克隆獲得的山羊KLF6序列設(shè)計(jì)其定量引物，檢測KLF6基因在簡州大耳羊各組織(心、肝、脾、肺、腎、背最長肌、股二頭肌、臂三頭肌、皮下脂肪、腹間脂肪、瘤胃和胰腺)中的表達(dá)差異。qPCR反應(yīng)體系為SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)10 μL、Primer F(10 μmoL/L)1.0 μL、Primer R(10 μmoL/L)1.0 μL、模板cDNA 1.0 μL，ddH2O 7 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)生物學(xué)及3個(gè)技術(shù)重復(fù)，并設(shè)置陰性對(duì)照，引物序列見表1。

1.2.5 山羊KLF6基因時(shí)序表達(dá)檢測 取本實(shí)驗(yàn)保存[15]的山羊皮下脂肪細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)，加入適量完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清，90%DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，10 kU/L青鏈霉素)培養(yǎng)，按照1∶3傳代接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔2 d換一次液。將F3細(xì)胞傳代至12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長至80%時(shí)，利用含10 mg/L 胰島素和150 μmol/L油酸的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至不同時(shí)間收集用于檢測KLF6基因在分化過程中的表達(dá)情況。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用2-ΔΔCt法[16]對(duì)qPCR數(shù)據(jù)均一化處理，組織表達(dá)以心臟組織為對(duì)照，以TBP[17]為內(nèi)參基因，細(xì)胞試驗(yàn)以0 d為對(duì)照，以UXT[18]為內(nèi)參基因(表1)。顯著性檢驗(yàn)利用SPSS 22.0軟件中One-way ANOVA分析，當(dāng)P<0.05，則差異顯著，當(dāng)P<0.01時(shí)，則差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊KLF6基因的克隆及理化性質(zhì)分析

利用RT-PCR方法，以簡州大耳羊脂肪組織cDNA為模板克隆得到KLF6核苷酸序列，序列總長為1 233 bp，其中包含ORF區(qū)957 bp，5′UTR序列123 bp，3′UTR序列153 bp，其終止密碼子為TGA，編碼318個(gè)氨基酸殘基(圖1)。山羊KLF6氨基酸序列的理化性質(zhì)預(yù)測顯示，該蛋白分子式為C1532H2354N442O488S16，其蛋白分子量為35.285 17 ku，理論等電點(diǎn)為6.20，不穩(wěn)定指數(shù)為47.72，親水性總平均值為-0.731，說明該蛋白為親水酸性蛋白。氨基酸組成顯示絲氨酸(Ser)占13.8%，為組成氨基酸比例最高(圖2)，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基(Asp+Glu)總數(shù)為42，帶正電荷的氨基酸殘基(Arg+Lys)總數(shù)為36，因此該蛋白整體帶負(fù)電。

2.2 山羊KLF6生物信息學(xué)分析

磷酸化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果顯示，山羊KLF6蛋白潛在的磷酸化位點(diǎn)共53個(gè)，其中酪氨酸(Tyr)、絲氨酸(Ser)及蘇氨酸(Thr)磷酸化位點(diǎn)的個(gè)數(shù)分別為5，37，11，有20個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，分別為8個(gè)蘇氨酸糖(Thr)基化位點(diǎn)和12個(gè)絲氨酸(Ser)糖基化位點(diǎn)，存在1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)(圖1)；同時(shí)分析發(fā)現(xiàn)山羊KLF6蛋白無信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域，其主要功能位于細(xì)胞核(95.7%)，其次是液泡(4.3%)。KLF6蛋白結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示(圖3-A)，其可能由總氨基酸的19.18%(61個(gè)氨基酸)形成α-螺旋、12.26%(39個(gè)氨基酸)形成延伸鏈及68.55%(218個(gè)氨基酸)形成無規(guī)則卷曲(圖3-B)。KLF6具有典型的鋅指(C2H2)結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)域由3個(gè)鋅指殘基構(gòu)成，分別定位于235-259，265-289和295-317(圖1)，三維結(jié)構(gòu)也顯示了鋅指家族的典型特征(圖3-C)。蛋白相互作用分析發(fā)現(xiàn)，KLF6蛋白可能和SART1、JUN、ATF3、RAB5A、PA2G4、ST13、CDK2AP1等蛋白存在相互作用(圖4)。

2.3 山羊KLF6同源比較及進(jìn)化樹構(gòu)建

利用NCBI在線比對(duì)程序Blast，將獲得的山羊KLF6核苷酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，山羊KLF6核苷酸序列與綿羊、牛和印度水牛的同源性最高，分別為99.6%，98.5%和98.1%(圖5-A)。將獲得的山羊KLF6氨基酸序列與其他動(dòng)物的預(yù)測氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與綿羊、牛和印度水牛的氨基酸序列同源性最高，皆達(dá)到99.6%以上，而與大鼠、豬、小鼠、野駱駝、馬、獼猴、人、雞的同源性依次是87.4%，86.4%，86.2%，86.1%，85.5%，83.6%，83.3%，77.3%，表明KLF6在哺乳動(dòng)物中高度保守，同時(shí)利用MEGA 7.0軟件將各物種的氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5-B)。

2.4 山羊KLF6基因組織表達(dá)差異分析

為探討KLF6基因在山羊組織中的表達(dá)情況，本研究利用qPCR技術(shù)檢測了山羊14個(gè)組織中KLF6基因的mRNA表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖6)，KLF6基因在山羊各組織中廣泛表達(dá)，并在山羊腹脂中的表達(dá)極顯著高于其他各個(gè)組織(P<0.01)，其次是皮脂和肺臟中，而在瘤胃和胰腺中表達(dá)最低。

2.5 山羊KLF6基因時(shí)序表達(dá)差異分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證KLF6在脂肪中的調(diào)控作用，本研究檢測KLF6在山羊皮下脂肪細(xì)胞分化不同階段的mRNA水平，并以0 h的表達(dá)為對(duì)照，qPCR檢測結(jié)果顯示(圖7)，在皮下脂肪細(xì)胞分化中，KLF6的相對(duì)表達(dá)量在分化0～24 h變化不顯著，在分化24～96 h呈先上升后下降的趨勢(shì)極顯著上升(P<0.01)，并在60 h達(dá)到峰值。

3 討論與結(jié)論

KLF6基因作為KLFs中的重要一員，在哺乳動(dòng)物中KLF6也被確定為調(diào)控脂肪分化、脂肪形成和肥胖轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵組成部分[14]，本試驗(yàn)成功克隆獲得山羊KLF6基因序列1 233 bp，其中包含CDS區(qū)957 bp，編碼318個(gè)氨基酸，氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)其具有多個(gè)磷酸位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)，而蛋白質(zhì)翻譯后修飾有磷酸化和糖基化等方式[19]，推測這些位點(diǎn)是KLF6蛋白翻譯后的關(guān)鍵修飾位點(diǎn)，以保證KLF6蛋白能夠發(fā)揮正常功能。KLF6蛋白無信號(hào)肽剪切點(diǎn)和跨膜結(jié)構(gòu)域，主要在細(xì)胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用，這與其調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄的發(fā)生場所一致。且KLF6蛋白含有3個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，分別定位在235-259,265-289和295-317位點(diǎn)處，這與KLFs蛋白具有3個(gè)高度同源的C-端鋅指(C2H2)結(jié)構(gòu)的報(bào)道一致[20]，有研究表明，這些結(jié)構(gòu)域能夠有效地結(jié)合DNA分子上富含GC的序列(GC盒或CACCC元件)[21]，或者與蛋白質(zhì)互作發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用[22]。KLF6的核苷酸序列及氨基酸序列與綿羊和牛的親緣關(guān)系最近，其次是豬和大鼠，表明反芻動(dòng)物KLF6基因的進(jìn)化來源可能具有同一性，在生物學(xué)功能上存在較小的差異。KLF6蛋白相互作用分析預(yù)測其可能與ATF3、PA2G4及JUN等蛋白存在相互作用，研究顯示KLF6能夠直接結(jié)合并激活A(yù)TF3啟動(dòng)子進(jìn)而誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡[23]，KLF6還通過ATF4-ATF3-CHOP途徑參與細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控[24]，同時(shí)侯巧燕等[25]的研究顯示，在抑制癌細(xì)胞的增殖過程中KLF6與JUN存在拮抗作用。

本研究進(jìn)一步明確了KLF6的組織表達(dá)規(guī)律，結(jié)果顯示，該基因在山羊組織中廣泛表達(dá)，并在山羊腹脂中極顯著高于其他各個(gè)組織，其次是皮脂和肺臟。Chi等[26]在藏雞中研究發(fā)現(xiàn)KLF6在肺臟中高表達(dá)，在藏山羊中發(fā)現(xiàn)在肺臟、脾臟及脂肪組織中有較高表達(dá)[27]，朱江江等[28]研究發(fā)現(xiàn)，牦牛中KLF6高表達(dá)與肺臟和皮下脂肪，這與本研究存在相似及不同之處，該基因在青藏高原物種中的肺組織高表達(dá)，推測其可能與高原物種氧濃度適應(yīng)有關(guān)。賈魯?shù)萚29]研究指出，KLF6在大黃魚的腎、肝組織中高表達(dá)，推測該基因的組織表達(dá)具有物種差異性。

基于KLF6基因在山羊脂肪組織中高表達(dá)的結(jié)果，推測其預(yù)示著其可能參與脂肪沉積，為了進(jìn)一步的確定該推測，本研究檢測了KLF6在山羊皮下脂肪細(xì)胞分化不同階段的mRNA水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)山羊KLF6基因在皮下脂肪細(xì)胞分化60 h的表達(dá)水平極顯著高于前體脂肪細(xì)胞的表達(dá)水平。這與KLF6在3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化過程中相似的表達(dá)模式[10]，根據(jù)KLF6在分化前后的山羊皮下脂肪細(xì)胞分化中的表達(dá)水平及結(jié)合在3T3-L1中的研究結(jié)果，推測KLF6基因促進(jìn)山羊脂肪細(xì)胞分化。而KLF6對(duì)山羊脂肪細(xì)胞分化的具體調(diào)控作用及調(diào)控機(jī)制，則需要利用過表達(dá)、干擾和信號(hào)通路等方法和途徑來進(jìn)一步闡明。

本研究克隆得到山羊KLF6基因序列1 233 bp，其中CDS序列957 bp，編碼318個(gè)氨基酸殘基，具有3個(gè)典型鋅指。KLF6基因在山羊脂肪組織中高表達(dá)。KLF6在分化60 h的山羊皮下脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平極顯著高于前體脂肪細(xì)胞中的表達(dá)水平。結(jié)果將為解析山羊KLF6基因的功能以及其在脂肪細(xì)胞分化中的調(diào)控作用奠定理論基礎(chǔ)。