磁共振pH 成像原理及其在腫瘤酸性微環(huán)境形成機(jī)制及其發(fā)展演變中的研究進(jìn)展

姜煒琪，姜萌，阿榮，孫夕林

惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康、降低患者生活質(zhì)量，是世界第二大致死原因，已成為全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)全球腫瘤流行病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)顯示，至2030 年，每年將有1300萬(wàn)人死于癌癥[1]。自20世紀(jì)70年代以來(lái)，中國(guó)惡性腫瘤病死率上升了142.85%[2]。腫瘤細(xì)胞會(huì)通過(guò)特殊的代謝途徑產(chǎn)生不利于正常體細(xì)胞生存生長(zhǎng)的細(xì)胞外微環(huán)境，同時(shí)會(huì)上調(diào)各種基因表達(dá)和蛋白生物合成以增加其侵襲性和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散能力，導(dǎo)致實(shí)體瘤對(duì)放療、部分化療等傳統(tǒng)癌癥治療方法產(chǎn)生耐受性[3]。準(zhǔn)確診斷腫瘤的病理狀態(tài)對(duì)其早期確診、正確疾病管理、進(jìn)行個(gè)體化治療至關(guān)重要。腫瘤細(xì)胞外酸性微環(huán)境是實(shí)體瘤的特征之一，pH 調(diào)節(jié)機(jī)制是腫瘤細(xì)胞存活的重要組成部分，其逆轉(zhuǎn)可阻止原發(fā)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，能夠非侵入地量化腫瘤細(xì)胞外pH 的工具有極大的可能性進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。磁共振成像技術(shù)由于其非侵入性、無(wú)放射性損傷、高空間分辨率和深組織穿透性等前提，具有較高的病理成像潛力，已作為常規(guī)輔助檢查技術(shù)廣泛應(yīng)用于臨床。近年來(lái)，科研人員致力于以磁共振成像方法作為技術(shù)核心，研究腫瘤組織無(wú)創(chuàng)在體、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)、定性定量pH 檢測(cè)的全新評(píng)估手段，以提供腫瘤組織代謝相關(guān)以及分子功能水平的生物學(xué)信息。本文從腫瘤酸性微環(huán)境的形成機(jī)制及其病理生理學(xué)意義出發(fā)，對(duì)目前現(xiàn)有的磁共振pH 成像技術(shù)及方法展開(kāi)評(píng)述，并針對(duì)其在本領(lǐng)域的優(yōu)缺點(diǎn)及臨床應(yīng)用現(xiàn)況或臨床轉(zhuǎn)化的機(jī)遇與挑戰(zhàn)進(jìn)行探討，以促使新型磁共振pH成像技術(shù)方法及pH敏感磁共振分子成像探針的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)，并為其臨床應(yīng)用前景及效用評(píng)估提供數(shù)據(jù)支持。

1 腫瘤細(xì)胞外酸性微環(huán)境

與正常體細(xì)胞不同，腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)pH (intracellular pH，pHi)大于7.2，細(xì)胞外pH (extracellular pH，pHe)為6.7～7.1，這種特殊的腫瘤pH梯度稱(chēng)為“反向pH梯度”，細(xì)胞外酸性環(huán)境是實(shí)體瘤的特征之一。Warburg效應(yīng)表明，即使有充足的氧氣支持線粒體呼吸，腫瘤細(xì)胞也能夠?qū)⑵咸烟寝D(zhuǎn)化生成乳酸[4]，這種有氧糖酵解的代謝特征低能耗但可快速產(chǎn)生熱量。為避免細(xì)胞內(nèi)酸中毒，腫瘤細(xì)胞會(huì)上調(diào)部分質(zhì)子泵的表達(dá)及活性將質(zhì)子及乳酸釋放至胞外環(huán)境，質(zhì)子泵包括Na+/HCO3-共轉(zhuǎn)運(yùn)體(Na+/HCO3-cotransporter，NBC)[5]、液泡H+-ATPases (V-ATPases)[6]、Na+/H+交 換 體(Na+/H+exchanger，NHE)[7]、單 羧 酸 轉(zhuǎn) 運(yùn) 體(monocarboxylate transporter，MCTs)[8]、碳 酸 酐 酶(carbonic anhydrases，CA)[9](圖1)。

實(shí)體瘤惡性微環(huán)境已成為癌癥患者死亡的主要原因[10]。實(shí)驗(yàn)表明，與pH 為7.4 相比，在pH 為7.0 的條件下進(jìn)行48 h細(xì)胞培養(yǎng)，裸鼠靜脈注射人黑色素瘤細(xì)胞后肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生率約增加1 倍[11]，這是由于酸性的細(xì)胞pHe 限制了HCO3-的緩沖作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)力學(xué)活性，進(jìn)而激活酸激活蛋白酶，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散[12]。此外，酸性環(huán)境有助于腫瘤化學(xué)抵抗、阻礙機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫排斥、降低部分弱堿性抗腫瘤藥物的治療作用[13]。綜上所述，腫瘤細(xì)胞外pH 的無(wú)創(chuàng)在體、定性定量、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的監(jiān)測(cè)在其臨床診斷、指導(dǎo)治療、療效監(jiān)測(cè)中起重要作用，目前已研發(fā)出部分具有pH 檢測(cè)作用的技術(shù)和方法，為精準(zhǔn)醫(yī)療提供了全新研究方向。

2 現(xiàn)有腫瘤組織pH檢測(cè)技術(shù)及方法

傳統(tǒng)測(cè)定組織酸堿度的方法主要包括：微電極法，測(cè)量結(jié)果較為精準(zhǔn)但有創(chuàng)；熒光光譜法，可污染組織細(xì)胞[14]；正電子發(fā)射斷層分子成像，可快速觀察機(jī)體整體情況但成本昂貴且有輻射；磁共振技術(shù)，憑借高空間分辨率、無(wú)放射損傷、無(wú)創(chuàng)實(shí)時(shí)在體等優(yōu)異性能，具有廣闊的腫瘤組織pH 檢測(cè)臨床應(yīng)用潛力。

3 磁共振pH成像技術(shù)

磁共振pH 成像技術(shù)是采用磁共振成像方法來(lái)分辨pH 值不同的組織之間成像強(qiáng)度差異，其技術(shù)原理基于以下兩點(diǎn)：(1)pH 依賴(lài)以及非pH 依賴(lài)共振之間的化學(xué)位移差異來(lái)測(cè)量組織pH；(2)使用pH 敏感的對(duì)比劑改變弛豫，進(jìn)而評(píng)估腫瘤細(xì)胞外環(huán)境的pH 變化。磁共振波譜和磁共振波譜成像技術(shù)可準(zhǔn)確無(wú)創(chuàng)地進(jìn)行在體pH值測(cè)量[15]，最常用的31P譜技術(shù)即根據(jù)組織代謝產(chǎn)物磁共振頻譜中無(wú)機(jī)磷和磷酸肌酸化學(xué)位移的差值，與參考曲線進(jìn)行比較計(jì)算組織的pHi 值[16]，但其時(shí)空分辨率較低，需維持組織長(zhǎng)時(shí)間的生理穩(wěn)定狀態(tài)，臨床應(yīng)用受限。而MRI 技術(shù)可以解決上述問(wèn)題，成為目前腫瘤組織pH 測(cè)量的主要方法。同時(shí)，隨著磁共振分子成像技術(shù)的發(fā)展，可在活體狀態(tài)下研究及評(píng)估腫瘤酸性環(huán)境的代謝相關(guān)功能分子水平機(jī)制[17]。1H 磁共振成像技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床，為減少機(jī)體因質(zhì)子含量豐富所產(chǎn)生的背景信號(hào)，許多pH 成像技術(shù)研究集中在探索除1H 原子外的其他核磁共振原子，以下將介紹13C、19F、1H磁共振pH成像技術(shù)的研究進(jìn)展。

3.1 13C-MR成像

除質(zhì)子外，腫瘤組織pH 值也受碳酸氫鹽緩沖系統(tǒng)控制。13C- 碳酸氫鹽和13CO2的pH 依賴(lài)化學(xué)平衡可以使用Henderson-Hasselbalch方程來(lái)計(jì)算：

其中，pKa 是離解常數(shù)，在機(jī)體內(nèi)為6.17，超極化13C 標(biāo)記的碳酸氫鹽和CO2信號(hào)與各自分子濃度對(duì)應(yīng)，通過(guò)這些信號(hào)的比值可以進(jìn)行pH 值估計(jì)。13C 通過(guò)質(zhì)子去耦合和動(dòng)態(tài)核極化(dynamic nuclear polarization，DNP)[18]增加13C 頻譜的敏感性并使其分子信噪比提高。通過(guò)構(gòu)建專(zhuān)門(mén)的射頻線圈、開(kāi)發(fā)新脈沖序列進(jìn)行13C 的信號(hào)采集，可以將DNP 技術(shù)應(yīng)用于腫瘤pH 值的檢測(cè)[19]。Ferdia 等[20]通過(guò)研究得出，化學(xué)位移成像顯示動(dòng)物體內(nèi)存在超極化的碳酸氫鹽信號(hào)，其中主動(dòng)脈檢測(cè)到的含量最高，而在腫瘤內(nèi)主要發(fā)現(xiàn)了超極化的13CO2，逐體素分析證實(shí)，與周?chē)＝M織相比，腫瘤pHe呈酸性，此技術(shù)稱(chēng)為pH mapping，即對(duì)比劑介導(dǎo)的、使用DNP生成增強(qiáng)的碳酸氫鹽比值成像。Hundshammer 等[21]應(yīng)用超極化的[1,5-[13]C2]偶氮酸(ZA)及其衍生物[1,5-[13] C2,3,6,6,6-D4]右旋酸(ZAd)作為新型細(xì)胞pHe MRI 探針，利用DNP 技術(shù)對(duì)MRI 信號(hào)進(jìn)行了10000 倍以上的增強(qiáng)，大鼠皮下MAT B Ⅲ腺癌在體實(shí)驗(yàn)表明，ZA 能夠測(cè)量并區(qū)分腫瘤血管內(nèi)外pH。此外，ZA 的氘化顯著延長(zhǎng)其縱向弛豫時(shí)間并增加靈敏度，可用于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)體內(nèi)pH 變化。然而，由于對(duì)13C 線圈的要求較高以及通過(guò)DNP 產(chǎn)生超極化分子的技術(shù)難度較大，阻礙了這種有前景技術(shù)的臨床應(yīng)用，因此研究產(chǎn)生超極化分子的其他途徑有助于該技術(shù)方法早期應(yīng)用于臨床。目前科研工作者正致力于建立一種提供高信噪比和空間依賴(lài)性的臨床工具，以允許超極化13C-DNP pH mapping 與磁共振分子成像結(jié)合起來(lái)，達(dá)到磁共振成像提供腫瘤組織相關(guān)的高質(zhì)量質(zhì)子加權(quán)圖像，超極化13C 代謝MR 顯示相應(yīng)的生化和pH 值信息的目的[22-23]。同時(shí)，開(kāi)發(fā)新型MRI 序列進(jìn)行快速圖像采集以及設(shè)計(jì)接收器線圈來(lái)改進(jìn)信號(hào)檢測(cè)將允許該技術(shù)達(dá)到亞毫米空間分辨率，對(duì)肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等實(shí)體瘤進(jìn)行高分辨率pH 成像。

3.2 19F-MR成像

19F 天然豐度為百分之百，具有較高的旋磁比，最外層的7 個(gè)電子使其化學(xué)位移對(duì)局部環(huán)境十分敏感。氟元素僅存在于機(jī)體骨骼與牙齒中，使19F 探針有益于腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和追蹤，賦予其進(jìn)行MRI 核素成像的巨大潛力。目前已有研究使用氟化維生素B6 衍生物來(lái)研究兔心肌細(xì)胞內(nèi)外pH[24]。19F MRI 功能納米探針的開(kāi)發(fā)近年來(lái)受到了廣泛的關(guān)注，其中pH敏感的19F MRI 探針尤具吸引力。大多數(shù)pH 響應(yīng)性19F MRI 納米探針是含叔胺的氟化聚合物納米顆粒，隨著pH 值的變化，這些聚合物鏈可以通過(guò)三級(jí)氨基的質(zhì)子化和去質(zhì)子化而膨脹或收縮，進(jìn)而導(dǎo)致19F-MRI 信號(hào)的激活或消失。Guo 等[25]設(shè)計(jì)了一種pH 響應(yīng)19F MRI 納米探針，命名為FNPs-PEG，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示當(dāng)pH 值從7.4 降低到5.5 時(shí)，19F MRI 的信號(hào)強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，并且荷瘤鼠在體實(shí)驗(yàn)可采集到較強(qiáng)的19F 信號(hào)，說(shuō)明該探針有望作為啟動(dòng)19F MRI pH 成像的對(duì)比劑。隨著研究進(jìn)展開(kāi)發(fā)出了多功能19F 納米探針進(jìn)行雙?；蚨嗄B(tài)腫瘤細(xì)胞對(duì)比pH 成像[26]，或使用pH 敏感的19F 探針進(jìn)行雙核或多核素對(duì)比增強(qiáng)成像并采集相應(yīng)信號(hào)用于組織pH 檢測(cè)[27]。氟化探針毒性較低，具有一定的生物安全性，有利于臨床轉(zhuǎn)化，但由于19F-MRS及19F-MRI的檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，因此應(yīng)改進(jìn)掃描時(shí)間、脈沖序列或線圈設(shè)計(jì)來(lái)提高檢測(cè)靈敏度并獲得高分辨率圖像。共包埋其他顯像劑和藥物或聯(lián)合其他技術(shù)方法進(jìn)行19F-MR 腫瘤pH 成像，可為多模態(tài)成像和診療一體化研究開(kāi)辟新的方向，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

3.3 氫質(zhì)子磁共振波譜成像

3.3.1 化學(xué)交換飽和轉(zhuǎn)移磁共振成像

化學(xué)交換飽和轉(zhuǎn)移(chemical exchange saturation transfer，CEST)成像技術(shù)通過(guò)飽和特定的可轉(zhuǎn)移質(zhì)子使其與水中質(zhì)子進(jìn)行交換，其對(duì)比度受pH、可交換位點(diǎn)濃度、溫度等調(diào)節(jié)可交換質(zhì)子化學(xué)環(huán)境因素的影響，因此可以通過(guò)觀察水信號(hào)的改變進(jìn)而間接獲得pH值空間或時(shí)間分布的對(duì)比成像[28]。

CEST 成像主要分為以下三類(lèi)：抗磁性CEST (diamagnetic CEST，DIACEST)、順磁性CEST (paramagnetic CEST，PARACEST)和酰胺質(zhì)子轉(zhuǎn)移(amide proton transfer，APT)。DIACEST 對(duì)比劑是包含胺和羥基等化學(xué)基團(tuán)的有機(jī)物質(zhì)，Wolff 和Balaban[29]首次證實(shí)，在RF脈沖飽和情況下可進(jìn)行DIACEST成像。PARACEST 對(duì)比劑是鑭系元素和有機(jī)螯合物的復(fù)合物，Pagel團(tuán)隊(duì)[30]開(kāi)發(fā)了一種新型PARACEST對(duì)比劑Yb-DO3A-oAA，它具有兩個(gè)pH 值響應(yīng)CEST 中心、不同MR 頻率和不同的pH 依賴(lài)性，可在不飽和輻射下進(jìn)行量化、減輕SAR 值影響。APT 技術(shù)可以選擇組織內(nèi)源性蛋白質(zhì)及多肽的酰胺質(zhì)子作為飽和目標(biāo)，通過(guò)測(cè)量水信號(hào)的變化，間接獲得交換率計(jì)算組織pH[31]，其空間分辨率良好但其時(shí)間分辨率較低，目前主要應(yīng)用于阿爾茨海默癥[32]的研究。

碘類(lèi)對(duì)比劑具有可交換的氫質(zhì)子酰胺基團(tuán)，由于其極高的生物安全性，已被用于MRI-CEST pH mapping 的臨床試驗(yàn)。Longo 等[33]使用碘比醇(僅含有一套酰胺質(zhì)子且CEST 作用強(qiáng)烈依賴(lài)于pH 的對(duì)比劑)選擇性施加不同功率的射頻脈沖并通過(guò)比值測(cè)定法獲得不同脈沖功率下的CEST 信號(hào)可檢測(cè)感興趣區(qū)的pH 值。通過(guò)實(shí)驗(yàn)獲得其1.5μT(a)和6μT(b)的RF 飽和脈沖下的ST 圖像，通過(guò)計(jì)算處理獲得其不同pH 下的pH map(圖2A)。該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步對(duì)腫瘤細(xì)胞pHe 進(jìn)行成像，并在異種移植乳腺腫瘤的小鼠模型中獲得了成功(圖2B)。此外，碘帕醇已被用于提供卵巢癌或乳腺癌患者的腫瘤pHe 成像[34]。以上成功的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究CEST MR pH 成像鋪平了道路，確認(rèn)了腫瘤pHe mapping 在診斷和療效監(jiān)測(cè)的臨床效用。通過(guò)開(kāi)發(fā)新型CEST MR 成像技術(shù)、提高對(duì)比劑的靈敏性及安全性、減少磁場(chǎng)條件以及掃描序列或組織內(nèi)源性干擾因素的限制，CEST MR 成像技術(shù)有望提供準(zhǔn)確的pH 測(cè)量和多種生物體功能信息，并早期應(yīng)用于臨床腫瘤組織pH 值監(jiān)測(cè)。

3.3.2 MRI對(duì)比增強(qiáng)

pH 響應(yīng)性順磁性釓對(duì)比劑GdDOTA-4AmP5-中膦酸鹽側(cè)臂質(zhì)子化形成的氫鍵可進(jìn)行氫交換，但其測(cè)量結(jié)果高度依賴(lài)于每個(gè)成像體素中的試劑濃度，難以直接獲得溶液pH 值[35]。Gillies 等[36]先后注射同劑量的GdDOTA-4AmP5-和GdDOTP5-(后者pH 不響應(yīng))對(duì)腦膠質(zhì)瘤的小鼠腫瘤組織進(jìn)行了pH 成像：假設(shè)兩種藥物具有相同的藥代動(dòng)力學(xué)和組織生物分布，pH不敏感釓劑的分布可以用來(lái)預(yù)測(cè)pH 敏感釓劑的濃度，通過(guò)對(duì)比灌注后二者的最大信號(hào)強(qiáng)度圖的差異得到pH 圖，但因其費(fèi)時(shí)且這些常規(guī)的對(duì)比劑特異性差，其臨床應(yīng)用潛力有限。

MRI 傳統(tǒng)對(duì)比劑的靈敏度和特異性的相對(duì)不完美促使人們尋找并研發(fā)靶向性和生物安全性更高的磁共振分子成像探針，以腫瘤組織的細(xì)胞外酸性環(huán)境為激活信號(hào)，在腫瘤區(qū)域中激活的納米級(jí)pH 敏感性對(duì)比劑應(yīng)運(yùn)而生[37]，并在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究中展示出了其巨大的潛能與優(yōu)勢(shì)。Mi 等[38]設(shè)計(jì)了一種pH 響應(yīng)的、可迅速放大磁共振信號(hào)的納米對(duì)比探針PEGMnCaP，他們使用pH 敏感的磷酸鈣納米顆粒封裝具有縮短腫瘤周?chē)鷼滟|(zhì)子T1弛豫時(shí)間的Mn2+。在酸性環(huán)境下，納米包殼裂解釋放Mn2+，選擇性地與蛋白質(zhì)結(jié)合并快速增強(qiáng)實(shí)體瘤T1信號(hào)值，精確地成像腫瘤及響應(yīng)其細(xì)胞外酸性環(huán)境的病理狀況。結(jié)腸癌皮下荷瘤鼠的在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pH 響應(yīng)的納米探針不僅能夠?qū)δ[瘤部位進(jìn)行特異性成像，而且還可以對(duì)腫瘤組織的pH 進(jìn)行監(jiān)測(cè)。但它們也存在著弛豫率低，體內(nèi)清除率過(guò)快且增強(qiáng)效果在成像結(jié)果中不明顯等缺點(diǎn)。隨著技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建具有高弛豫效率、良好生物相容性、高靶向性和低毒性的pH 響應(yīng)磁共振分子成像探針最有助于解決腫瘤生物學(xué)基本問(wèn)題、評(píng)估腫瘤酸中毒與侵襲性之間的關(guān)系以及監(jiān)測(cè)新型抗癌療法的效果。

4 展望

腫瘤的發(fā)展與轉(zhuǎn)移是復(fù)雜的、多程序和多步驟的，而每一關(guān)鍵過(guò)程都與其酸性微環(huán)境相關(guān)。新型的磁共振成像技術(shù)及高pH 響應(yīng)磁共振分子成像探針研發(fā)將在在體可視化腫瘤生物學(xué)行為、反映腫瘤酸中毒與侵襲性等機(jī)制和表征方面發(fā)揮重要作用。與治療藥物的臨床轉(zhuǎn)化極富挑戰(zhàn)性不同，新型診斷技術(shù)方法與相關(guān)設(shè)備的設(shè)計(jì)研發(fā)無(wú)疑是目前最具臨床應(yīng)用潛力、可提供早期精準(zhǔn)以及個(gè)體化治療方案的臨床轉(zhuǎn)化研究熱點(diǎn)。在過(guò)去10 年中，雖然已經(jīng)解決了部分成像技術(shù)的局限性如空間和時(shí)間分辨率低、pH 敏感性不足和臨床應(yīng)用可行性等問(wèn)題，然而磁共振pH 成像相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)方法和成像系統(tǒng)平臺(tái)還有待于突破，如：減少磁場(chǎng)狀態(tài)及條件對(duì)成像結(jié)果的干擾、優(yōu)化和提高信噪比，解決時(shí)間空間精準(zhǔn)匹配，縮短掃描時(shí)間、完善相關(guān)配套MR 硬件設(shè)施，開(kāi)發(fā)具有強(qiáng)大圖像數(shù)據(jù)處理軟件甚至研發(fā)多核素同步成像的磁共振設(shè)備等，以促使腫瘤酸性微環(huán)境磁共振pH 成像技術(shù)成為一種實(shí)時(shí)在體、具有臨床應(yīng)用前景的新型無(wú)創(chuàng)診斷工具，與此同時(shí)加強(qiáng)研發(fā)pH 敏感成像相關(guān)分子成像探針及納米遞送系統(tǒng)等設(shè)計(jì)，促使腫瘤診療一體化的研究與發(fā)展。相信在不久的將來(lái)，磁共振pH 成像技術(shù)將為腫瘤患者提供最具診斷價(jià)值、指導(dǎo)相應(yīng)臨床治療方案制訂、監(jiān)測(cè)治療療效以及預(yù)后隨診的優(yōu)先級(jí)臨床實(shí)踐影像學(xué)檢查診斷技術(shù)方法。

圖2 A：30 mmol/L碘比醇溶液在不同pH下的CEST-MR圖像；B：異種移植瘤小鼠靜脈注射碘比醇(劑量為4 gI/kg b.w.)的CEST-MR圖像Fig.2 A: CEST-MR images of 30 mmol/L iobitridol solution titrated at different pH values; B: CEST-MR images of xenografted-tumor bearing mouse following iobitridol i.v.injection(dose 4 gI/kg b.w.).

作者利益沖突聲明：全體作者均聲明無(wú)利益沖突。