陜西扶風(fēng)某生豬養(yǎng)殖場(chǎng)腸球菌分型與毒力基因檢測(cè)

廉魯昕，牛沁雅，曹晨陽(yáng)，盛煥精，李 偉，施春雷，史賢明，楊保偉

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2 上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海200240)

腸球菌(Enterococcus)是存在于人和其他動(dòng)物腸道中的一類常見(jiàn)條件致病菌，普遍存在于畜、禽生長(zhǎng)環(huán)境及以畜禽產(chǎn)品為原材料的食品生產(chǎn)和加工環(huán)境中[1]。以前，人們普遍認(rèn)為該菌對(duì)人和動(dòng)物無(wú)害而被作為益生菌添加到動(dòng)物飼料中，有研究表明，在仔豬飼糧中添加屎腸球菌可以改善生長(zhǎng)性能, 維持腸道菌群平衡, 有效增強(qiáng)免疫力[2]。雞飼糧中添加糞腸球菌能提高蛋雞的產(chǎn)蛋量、雞蛋蛋白高度和蛋黃顏色，降低血清和蛋黃總膽固醇含量，調(diào)節(jié)腸道微生物數(shù)量[3]。也有研究表明，糞腸球菌生長(zhǎng)繁殖速度快，能耐受胃腸道環(huán)境，對(duì)O1和O78型大腸桿菌具有抑制作用，適合制作微生態(tài)制劑[4]。然而，2017年CHINET細(xì)菌耐藥性的監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，腸球菌在醫(yī)院分離的革蘭氏陽(yáng)性臨床致病菌株中位列第二[5]，表明分布廣泛的腸球菌可能會(huì)引發(fā)人及動(dòng)物的多種感染，對(duì)食品安全和公共衛(wèi)生安全均存在嚴(yán)重威脅。

為評(píng)估腸球菌可能引起的豬肉食品安全性問(wèn)題，段志剛等[6]和黃奕雯等[7]先后對(duì)鄭州市零售鮮豬肉源腸球菌的亞型及江西省健康和腹瀉豬仔糞便中糞腸球菌攜帶的毒力基因進(jìn)行了研究，結(jié)果表明糞腸球菌、屎腸球菌及其所攜帶的毒力基因可能是引起豬肉食品安全問(wèn)題的重要因素。陳秀戀等[8]對(duì)泉州市熟肉制品中血溶性腸球菌的檢測(cè)結(jié)果也表明，腸球菌在豬肉食品中廣泛存在，并可引發(fā)潛在食物中毒風(fēng)險(xiǎn)。相對(duì)而言，目前針對(duì)生豬養(yǎng)殖場(chǎng)中腸球菌的流行、分布和毒力基因攜帶情況研究較少，使豬肉生產(chǎn)鏈中對(duì)腸球菌可能引起的安全性把控缺少理論數(shù)據(jù)支撐。為此，本研究以陜西省扶風(fēng)縣某生豬養(yǎng)殖場(chǎng)為研究對(duì)象，對(duì)分離于該養(yǎng)殖場(chǎng)不同環(huán)境及相關(guān)生物樣品的腸球菌進(jìn)一步進(jìn)行分型，并檢測(cè)了其攜帶的部分毒力基因，以期為評(píng)估由此可能帶來(lái)的豬肉食品安全問(wèn)題提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2015年12月和2016年4月，從陜西省扶風(fēng)縣某生豬養(yǎng)殖場(chǎng)采集同批生豬育肥前期和育肥后期的豬糞、豬鼻拭子、豬舍墻壁、豬舍地面、豬舍污水、豬舍土壤、豬槽、豬飼料、豬場(chǎng)空氣沉降物和豬場(chǎng)工作人員糞便樣品，用緩沖蛋白胨水(buffered peptone water,BPW)將樣品進(jìn)行1∶10稀釋后，在腸球菌增菌肉湯中進(jìn)行選擇性增菌，將培養(yǎng)后的增菌液劃線接種于mEI平板培養(yǎng)，挑取平板上帶有藍(lán)黑色暈輪的疑似菌落進(jìn)行驗(yàn)證，共分離鑒定出87株腸球菌。將分離菌株保存于西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物食品安全研究室。

瓊脂糖(Agarose)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，TaqDNA聚合酶、10×PCR Buffer、dNTPs、Mg2+、100 bp DNA Marker和DL2000 DNA Marker均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，引物由楊凌天潤(rùn)奧科生物科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1CU超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；微量移液槍、5415D小型臺(tái)式高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf；MyCircle PCR基因擴(kuò)增儀(Bio-Rad)、GEL DOC XR凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)、LAC-5080S高壓滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，北京科偉永興儀器有限公司；GNP-9080隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 腸球菌亞型分型 將保存于-80 ℃冰箱的菌株劃線接種于MHA平板進(jìn)行活化培養(yǎng)[9]，挑取單菌落制備DNA模板。使用PCR技術(shù)，基于糞腸球菌、屎腸球菌、雞腸球菌的特異性基因?qū)?7株腸球菌進(jìn)行分型，試驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1。

表1 腸球菌分型所用引物信息Table 1 Primer information for Enterococci subtyping

PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中10×Buffer 2.50 μL、Mg2+1.50 μL、dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2.00 μL、TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.25 μL、上下游引物(10 μmol/mL)各0.30 μL、ddH2O 13.15 μL、DNA模板5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，退火(退火溫度見(jiàn)表1)30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，低溫送至楊凌天潤(rùn)奧科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)Blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)進(jìn)行在線比對(duì)驗(yàn)證[6,10]。

1.3.2 毒力基因檢測(cè) 采用PCR方法,對(duì)ace、cylA、cylB、cylM、cylL1、efaA、esp、gelE、AS、asal和hyl等11種腸球菌中常見(jiàn)的毒力基因進(jìn)行篩查，引物序列[6,11-15]見(jiàn)表2。PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序同1.3.1，退火溫度如表2所示。

表2 腸球菌攜帶毒力基因檢測(cè)所用引物信息Table 2 Primer information for virulence gene detection carried by Enterococci

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010和Canoco 5軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)和圖像進(jìn)行處理，用SPSS 20.0和MINITAB 16軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)、蒙特爾檢驗(yàn)等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(P<0.05，表示差異顯著；P<0.01，表示差異極顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸球菌分型

2.1.1 亞型檢測(cè)結(jié)果 由圖1可知，從陜西省扶風(fēng)縣生豬養(yǎng)殖場(chǎng)采集樣品中分離出的87株腸球菌可被分為3種確定的亞型和1種其他類亞型，其中糞腸球菌檢出率最高，為57.5%，極顯著(P<0.01)高于屎腸球菌(10.3%)和雞腸球菌(4.6%);其他亞型腸球菌的檢出率為27.6%。

**表示檢出率間差異極顯著(P<0.01)** indicates significant difference among detection rates (P<0.01)

2.1.2 各亞型腸球菌在不同采樣點(diǎn)分離株中的檢出率 由于未在豬槽、豬飼料和豬場(chǎng)空氣沉降物中檢出腸球菌，所以僅對(duì)其他來(lái)源菌株進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可以看出，雞腸球菌(n=4)僅在豬舍墻壁源菌株(75.0%)和土壤源菌株(25.0%)中有檢出，檢出率間無(wú)顯著差異。糞腸球菌、屎腸球菌和其他類型腸球菌在6個(gè)采樣點(diǎn)分離的菌株中均有檢出。糞腸球菌(n=50)在豬糞源菌株中檢出率最高(40.0%)，且顯著(P<0.05)高于豬鼻拭子和豬舍墻壁源菌株(均為14.0%)、豬場(chǎng)工作人員糞便(以下簡(jiǎn)稱為人糞)源菌株(4.0%)和豬舍污水源菌株(2.0%)中的檢出率，與豬舍地面源菌株中的檢出率(26.0%)無(wú)顯著差異(P>0.05)。屎腸球菌(n=9)在各采樣點(diǎn)分離菌株中的檢出率均無(wú)顯著差異(P>0.05)，其中在豬舍地面源菌株中的檢出率最高(33.3%)，其次是人糞源菌株(22.2%)，豬糞、拭子、污水和土壤源菌株中的檢出率均為11.1%。其他類型腸球菌(n=24)在各采樣點(diǎn)分離株中的檢出率間無(wú)顯著差異(P>0.05)，其中豬鼻拭子源菌株中的檢出率最高(25.0%)，其他依次為豬糞(20.8%)和豬舍墻壁、地面(16.7%)、土壤(12.5%)及人糞(8.3%)。

圖柱上標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示不同采樣點(diǎn)間差異顯著(P<0.05)。下圖同Different lowercase letters indicate significant difference among different sampling sites (P<0.05).The same as below圖2 各亞型腸球菌在不同采樣點(diǎn)的檢出率Fig.2 Detection rates of Enterococci subtypes at different sampling sites

2.1.3 不同采樣點(diǎn)菌株中各亞型腸球菌的組成 由表3可以看出，不同采樣點(diǎn)源菌株中各亞型腸球菌的組成和比例不同。豬糞源菌株中，糞腸球菌檢出率(76.9%)顯著(P<0.05)高于其他類型腸球菌(19.2%)和屎腸球菌(3.9%)。豬鼻拭子源菌株中，屎腸球菌檢出率(7.1%)顯著(P<0.05)低于糞腸球菌(50.0%)和其他類型腸球菌(42.9%)。豬舍墻壁源菌株中，糞腸球菌(50.0%)、雞腸球菌(21.4%)和其他類型腸球菌(28.6%)檢出率間無(wú)顯著差異(P>0.05)。豬舍地面源菌株中，糞腸球菌檢出率(65.0%)顯著(P<0.05)高于其他類型腸球菌(20.0%)和屎腸球菌(15.0%)。豬舍污水源菌株中只檢出屎腸球菌和糞腸球菌(均為50.0%)。豬舍土壤源菌株中，屎腸球菌、雞腸球菌和其他類型腸球菌檢出率分別為20.0%，20.0%，60.0%，三者間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。豬場(chǎng)工作人員糞便中，糞腸球菌、屎腸球菌、其他類型腸球菌檢出率均為33.3%。

表3 不同采樣點(diǎn)菌株中各亞型腸球菌的檢出率Table 3 Detection rates of each subtype of Enterococci at different sampling sites %

2.2 毒力基因檢測(cè)

2.2.1 腸球菌中毒力基因檢測(cè) 由表4可以看出，在供試的11種毒力基因中，87株腸球菌中共檢出5種毒力基因，其中asal的檢出率最高(50.6%，其他依次為gelE(27.6%)、cylL1(19.5%)、ace(18.4%)和esp(1.2%)。asal的檢出率顯著(P<0.05)高于esp基因，其他基因檢出率間差異不顯著。

表4 腸球菌中毒力基因的檢測(cè)結(jié)果(n=87)Table 4 Detection of virulence genes in Enterococci isolates (n=87)

由圖3可以看出，5種毒力基因在各亞型腸球菌中的檢出情況不同。糞腸球菌(n=50)中，asal的檢出率(66.0%)顯著(P<0.05)高于gelE(34.0%)、cylL1(26.0%)和ace(22.0%)。屎腸球菌(n=9)中，asal、cylL1、esp、gelE、ace的檢出率分別為55.6%,44.4%,11.1%,66.7%和22.2%，相互間并無(wú)顯著差異(P>0.05)。雞腸球菌(n=4)中，asal、gelE和ace的檢出率分別為75.0%,25.0%，75.0%，三者之間無(wú)顯著差異(P>0.05)。其他類型腸球菌(n=24)中，只有asal被檢出，檢出率為12.5%。

圖3 不同毒力基因在各亞型腸球菌中的檢出率Fig.3 Detection rate of virulence gene among isolates of different Enterococci subtypes

2.2.2 不同采樣點(diǎn)腸球菌分離株中毒力基因的檢測(cè) 由圖4可以看出，5種毒力基因在不同采樣點(diǎn)分離菌中的檢出率具有一定差異。asal基因(n=44)在豬糞源菌株中的檢出率(36.4%)顯著(P<0.05)高于豬鼻拭子、豬舍污水和人糞源菌株中的檢出率(后者分別為9.1%,2.3%和4.5%)，而與豬舍墻壁源菌株、豬舍地面源菌株中的檢出率(20.5%,27.3%)間無(wú)顯著差異(P>0.05)。cylL1基因(n=17)在豬舍地面源菌株中的檢出率(41.2%)顯著(P<0.05)高于污水和人糞源菌株中的檢出率(均為5.9%)，與豬糞和豬鼻拭子源菌株中的檢出率(35.3%,11.8%)間無(wú)顯著差異(P>0.05)。esp基因(n=1)僅在豬舍地面源菌株中有檢出。gelE基因(n=24)在豬舍地面源菌株中的檢出率(37.5%)顯著(P<0.05)高于豬鼻拭子、墻壁、污水、土壤源菌株中的檢出率(8.3%,4.2%,8.3%,8.3%)，而與豬糞源菌株中的檢出率(33.3%)間無(wú)顯著差異(P>0.05)。ace基因(n=16)在豬糞(25.0%)、豬鼻拭子(18.8%)、豬舍墻壁(25.0%)、豬舍地面(25.0%)和豬舍土壤源菌株中的檢出率(6.3%)間無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.2.3 生豬育肥前后期菌株中毒力基因的檢測(cè) 表5顯示,在育肥前期和后期，ace、cylL1、esp、gelE和asal在所有源菌株中總檢出率分別為93.7%和6.3%，82.3%和17.7%，100%和0%，75.0%和25.0%及84.1%和15.9%。其中豬舍墻壁源菌株中g(shù)elE檢出率在育肥后期高于育肥前期，豬場(chǎng)工作人員糞便asal檢出率育肥前后相當(dāng),其他均表現(xiàn)為育肥前期高于育肥后期。

2.2.4 毒力基因的分布 毒力基因的分布在一定程度上受到采樣時(shí)間、采樣地點(diǎn)和菌株亞型的影響。由圖5可知，從陜西扶風(fēng)某生豬養(yǎng)殖場(chǎng)分離的87株腸球菌毒力基因的分布受采樣地點(diǎn)的影響較?。坏鞘懿蓸訒r(shí)間和菌株亞型的影響較大(P<0.01)，其對(duì)ace、esp和asal分布的影響尤其明顯。另外，菌株亞型對(duì)gelE、cylL1的分布也存在較為明顯的影響。

*標(biāo)記的因素對(duì)腸球菌毒力分布基因影響極顯著(P<0.01)Factors marked by * have significant effects on distribution of Enterococci virulence genes(P<0.01)圖5 腸球菌毒力基因與各影響因素間關(guān)系的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of relationship between virulence genes of Enterococci and various influencing factors

3 討 論

腸球菌是一種革蘭氏陽(yáng)性菌，其對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較一般細(xì)菌強(qiáng)，可在水、土壤及動(dòng)物腸道內(nèi)生存。腸球菌是人類和動(dòng)物腸道正常菌群的一部分，通常在引起腹腔和盆腔感染所分離的混合菌中被發(fā)現(xiàn)。腸球菌既往被認(rèn)為是人腸道的共棲菌，但近年來(lái)的研究證實(shí)腸球菌具有一定的致病力[16-17]。

李鵬[18]研究表明，在84株藏豬源腸球菌中，糞腸球菌和屎腸球菌高達(dá)76株，在腸球菌中的占比高達(dá)90.47%。段志剛等[6]在鄭州市多個(gè)市場(chǎng)中采集的零售鮮豬肉樣品中分離得到30株腸球菌，其中67%為糞腸球菌和屎腸球菌。本研究以從陜西省扶風(fēng)縣某豬場(chǎng)育肥前期和育肥后期豬生物樣品、豬場(chǎng)水體樣品、豬舍環(huán)境涂抹樣品、養(yǎng)殖工作人員糞便等樣品中分離到的腸球菌為材料，采用PCR方法對(duì)腸球菌進(jìn)行了亞型分型和常見(jiàn)毒力基因檢測(cè),結(jié)果表明，糞腸球菌和屎腸球菌2種亞型在腸球菌中占比較高，與李鵬[18]、段志剛等[6]的研究結(jié)果相一致，由此可以發(fā)現(xiàn)，生豬養(yǎng)殖環(huán)境中流行的腸球菌亞型與生豬、市售豬肉中流行的腸球菌亞型較為一致，表明生豬養(yǎng)殖環(huán)境中流行的腸球菌可能就是市售豬肉腸球菌的重要來(lái)源之一，成為影響市售豬肉安全的重要因素。本研究中，豬生物樣品和豬舍環(huán)境涂抹樣品中各亞型腸球菌的檢出率較高，可能與該豬場(chǎng)對(duì)豬糞便或豬舍清理方式及效率有關(guān)。為了防止生豬攜帶的腸球菌污染豬肉，導(dǎo)致食品安全事件發(fā)生，豬場(chǎng)應(yīng)加強(qiáng)豬糞處理與豬場(chǎng)地面清潔，避免腸球菌在豬場(chǎng)內(nèi)大范圍傳播。

在先前的研究中，劉利等[19]認(rèn)為細(xì)菌感染過(guò)程十分復(fù)雜，毒力基因特異性表達(dá)及其協(xié)調(diào)作用是致病菌侵襲宿主、導(dǎo)致宿主致病的主要機(jī)制；也有研究表明，腸球菌致病是由多種毒力基因表達(dá)產(chǎn)物協(xié)同作用的結(jié)果[20-21]。因此，腸球菌攜帶的毒力基因?qū)ιi養(yǎng)殖、豬肉及其產(chǎn)品安全至關(guān)重要。本研究對(duì)腸球菌中毒力基因的檢測(cè)結(jié)果表明，asal的檢出率最高，其次分別為gelE、cylL1、ace和esp，未檢出cylA、cylB和efaA等6種毒力基因。朱宏等[22]對(duì)感染尿路的腸球菌毒力基因分析發(fā)現(xiàn)，糞腸球菌毒力基因攜帶量顯著高于屎腸球菌，且糞腸球菌中asal的檢出率最高。本研究中毒力基因asal的檢出率最高，可能與糞腸球菌在供試菌株中占比最大有關(guān)。而該結(jié)果與黃奕雯等[7]對(duì)江西省豬源糞腸球菌中部分毒力基因的檢測(cè)結(jié)果(毒力基因檢出率由高到低依次為efaA、ace、gelE、agg、esp和cylA)略有不同，這可能與毒力基因傳播的地域性以及豬場(chǎng)主要流行的菌株特性有關(guān)。但本研究與朱宏等[22]、黃奕雯等[7]的研究及其他研究[23]相比，gelE、ace和esp基因的檢出率均比較高，表明其可能是腸球菌經(jīng)常攜帶的主要毒力基因。

本研究針對(duì)不同采樣點(diǎn)樣品源菌株毒力基因的檢測(cè)結(jié)果表明，多種毒力基因在豬糞源腸球菌中的檢出率均比較高，這可能與腸道是腸球菌存在的主要環(huán)境有關(guān)。在生豬育肥前、后期采集到的樣品中，育肥后期腸球菌毒力基因的攜帶率較育肥前期均有不同程度降低，推測(cè)可能隨著生豬的不斷生長(zhǎng)，豬自身的免疫力逐漸提高，豬體及養(yǎng)殖環(huán)境中腸球菌的種類趨于一致，其攜帶的毒力基因種類和數(shù)量逐漸減少。劉桂華等[24]對(duì)吉林省某生豬養(yǎng)殖場(chǎng)不同采樣點(diǎn)育肥前、后期采集的樣品進(jìn)行腸球菌分離，結(jié)果顯示育肥前期腸球菌的檢出率顯著高于育肥后期，育肥后豬齡增大，其本身對(duì)腸球菌感染的抵抗力有所增強(qiáng)，與本研究結(jié)果相同。比較亞型、采樣地點(diǎn)和采樣時(shí)間對(duì)毒力基因分布的影響，可知采樣時(shí)間和腸球菌亞型對(duì)其毒力基因分布的影響較大，與同類研究相比，本研究中采樣點(diǎn)對(duì)于毒力基因分布的影響明顯較小，此結(jié)果也可能與該生豬養(yǎng)殖場(chǎng)的衛(wèi)生管控情況相關(guān)。

大量研究結(jié)果證實(shí)，腸球菌會(huì)引發(fā)禽畜的多種疾病，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致死亡[25-26]。對(duì)腸球菌進(jìn)行有效的亞型分型和毒力基因檢測(cè)，為腸球菌致病機(jī)理等的進(jìn)一步研究奠定了良好基礎(chǔ)。依據(jù)本研究結(jié)果，可對(duì)豬場(chǎng)衛(wèi)生條件做出合理的判斷，進(jìn)而優(yōu)化衛(wèi)生及質(zhì)量管控措施，為臨床治療和食品衛(wèi)生安全提供有力的保障。