芹菜素對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡作用的研究

曲曉媛 盧強(qiáng) 賈世磊

本文主要研究芹菜素對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87凋亡的影響及機(jī)制。方法：應(yīng)用CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。Western-blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Bax的表達(dá)。結(jié)果：①芹菜素能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的增殖。②不同濃度的芹菜素作用24h，G2期細(xì)胞所占比例呈下降趨勢(shì)。③芹菜素處理組的細(xì)胞，Bcl-2蛋白的表達(dá)量隨著芹菜素濃度的增加而降低，Bax蛋白的表達(dá)量則隨芹菜素濃度的增加而升高。結(jié)論：芹菜素能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的增殖，并可能通過(guò)線粒體信號(hào)途徑誘導(dǎo)其凋亡。

膠質(zhì)瘤（glioma）是最常見(jiàn)的惡性程度極高的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，占顱內(nèi)惡性腫瘤的78%左右[1]。膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞，是一類高度血管化的腫瘤，具有彌漫性浸潤(rùn)性生長(zhǎng)、侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)、難切除、預(yù)后差[2，3]等特點(diǎn)， 其中位生存期只有一年左右[4-6]。在全身性惡性腫瘤中，惡性膠質(zhì)瘤5年病死率緊隨胰腺癌和肺癌之后，位居第3位[7，8]。

芹菜素是一種天然的黃酮類化合物[9]，低毒，無(wú)誘變性[10]，抗癌譜廣，是抗腫瘤藥研究的熱點(diǎn)之一，但其對(duì)膠質(zhì)瘤的確切作用及機(jī)制尚缺乏系統(tǒng)研究。本研究采用芹菜素對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87進(jìn)行體外干預(yù)，以研究芹菜素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。

材料與方法

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞系

選擇人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87作為研究對(duì)象，購(gòu)于北納生物有限公司。

主要試劑

芹菜素和RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司;DMEM完全培養(yǎng)液（1×）和CCK8法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;兔抗人Bcl-2、兔抗人Bax抗體、GAPDH均為美國(guó)CST公司產(chǎn)品;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;PVDF膜為Millipore公司產(chǎn)品。

方法

芹菜素工作液的制備? 原芹菜素濃度是10mmol/mL，需配制成20umol/L、40umol/L和80umol/L。將原芹菜素稀釋1000倍即得到濃度為10umol/mL的芹菜素濃度。依次將2uL、4uL和8uL芹菜素溶解在1mL相應(yīng)培養(yǎng)基中即可得到所需的實(shí)驗(yàn)濃度。

細(xì)胞培養(yǎng)? 將人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87置于含有10%胎牛血清、0.2%NaHCO3、0.3%HEPES 的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2 的恒濕孵箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，由于各細(xì)胞生長(zhǎng)周期不同，每2天換次培養(yǎng)液，3～5天用0.25%的胰酶消化傳代一次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞（即培養(yǎng)瓶底布滿80%時(shí)）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分組? 實(shí)驗(yàn)共分5組：芹菜素低濃度組（20 umol/L）、芹菜素中濃度組（40 umol/L）、芹菜素高濃度組（80 umol/L）、空白對(duì)照組（只加培養(yǎng)基）和陰性對(duì)照組（DMSO+培養(yǎng)基）。處理24h后收集所需細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

CCK8法檢測(cè)芹菜素對(duì)U87細(xì)胞增殖的影響

對(duì)細(xì)胞鋪板于96孔板貼壁后細(xì)胞換液，每孔100ul;每孔加入10ul CCK8試劑，按 20umol/L、40umol/L、80 umol/L濃度梯度設(shè)定的芹菜素工作液，分別處理實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中孵育2h;酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下，測(cè)吸光度（OD）值。同等條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，計(jì)算腫瘤細(xì)胞的存活率。腫瘤細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

用20umol/L、40umol/L、80 umol/L濃度芹菜素工作液處理U87細(xì)胞，培養(yǎng)24h，胰酶消化，PBS洗滌2次，離心，70%乙醇4℃固定過(guò)夜，PBS洗滌2次，離心，碘化丙啶染色，室溫避光孵育30分鐘。500ul PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化。

Western-blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)

用20umol/L、40umol/L、80 umol/L濃度芹菜素工作液處理U87細(xì)胞，24h后，收集細(xì)胞，3000r/min離心10min后，冰PBS沖洗，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min后，4℃，10000r/min離心10 min，小心吸取上清，獲得總蛋白并測(cè)定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，經(jīng)十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳1～2h，后濕法轉(zhuǎn)膜30～50min。加入GAPDH一抗（1：1000）、Bcl-2一抗（1：1000）、Bax一抗（1：1000）孵育，4℃過(guò)夜;加入山羊抗兔二抗（1：2000）室溫孵育1～2h。在膜上滴加電化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色液，在凝膠成像系統(tǒng)下成像并測(cè)定條帶灰度值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理數(shù)據(jù)。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。各項(xiàng)參數(shù)值之間的比較分別采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，以P <0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

芹菜素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87增殖的影響

CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示芹菜素對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87具有增殖抑制作用。與對(duì)照組比較，不同濃度的芹菜素工作液處理24h后，細(xì)胞生存率下降，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑制;并且隨著芹菜素濃度的增高，抑制細(xì)胞增殖的效果越明顯（圖1）。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果

分別用20umol/L、40umol/L、80 umol/L的芹菜素工作液處理U87細(xì)胞24h后，細(xì)胞周期各時(shí)相所占的比例不相同。隨芹菜素濃度的增加，G2期細(xì)胞所占比例呈下降趨勢(shì)。但20umol/L和40umol/L的芹菜素抑制細(xì)胞增殖的作用不明顯;芹菜素工作濃度增加至80umol/L時(shí)，則能明顯抑制細(xì)胞的增殖（圖2）。

凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)

分別用20umol/L、40umol/L、80 umol/L的芹菜素工作液處理U87細(xì)胞24h后，檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)。隨芹菜素濃度的增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，Bax蛋白的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)（圖3）。

討論

近年來(lái)，天然植物提取物單體以其對(duì)正常細(xì)胞毒性小，對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞毒性大和促凋亡而備受青睞。

芹菜素，又稱芹黃素，是一種天然的黃酮類化合物，廣泛存在于自然界中，以植物黃色素的形式在茶葉、蔬菜、水果、豆類和香料中廣泛分布，中藥如地錢、西藏雪蓮花、車前子、絡(luò)石藤等中也有很高的含量，其中以芹菜根的含量最為豐富，目前已經(jīng)可以人工合成。通過(guò)大量研究發(fā)現(xiàn)芹菜素具有抗腫瘤、抗突變、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗焦慮、保護(hù)心血管、保護(hù)中樞神經(jīng)等多種生物活性，其中其抗腫瘤作用最為突出，并且與其他黃酮類物質(zhì)（ 如槲皮素、山奈黃酮等） 相比，具有低毒性及無(wú)誘變性等優(yōu)點(diǎn)[10]。

芹菜素抗腫瘤作用[11-12]的主要機(jī)制有：（1）調(diào)控細(xì)胞周期運(yùn)行，抑制腫瘤細(xì)胞增殖;（2）誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;（3）干擾腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo);（4）抑制腫瘤血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移。孫悅等[13-14]的研究表明，芹菜素可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，并且誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用呈現(xiàn)藥物濃度依賴性，同時(shí)證明芹菜素誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要是通過(guò)Bcl-2/Bax-Caspase-3、Caspase-9的線粒體凋亡通路活化實(shí)現(xiàn)的。SHUKLA等[15]研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素可通過(guò)誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，從而有效抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，抑制作用表現(xiàn)出現(xiàn)藥物濃度依賴性。

本研究中，CKK8法檢測(cè)結(jié)果顯示，芹菜素能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的增殖;并且隨著芹菜素濃度的增加，對(duì)瘤細(xì)胞增殖抑制的作用也越明顯，與貢偉一等[16]的研究結(jié)果一致。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的結(jié)果顯示，高濃度的芹菜素可明顯減少膠質(zhì)瘤細(xì)胞G2期的細(xì)胞數(shù)目，提示芹菜素可調(diào)控細(xì)胞周期的運(yùn)行，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖能力。在隨后進(jìn)行的凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的研究中，我們的結(jié)果顯示芹菜素能夠上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，而B(niǎo)cl-2蛋白的表達(dá)則降低;并且隨著芹菜素濃度的增加，Bax蛋白的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，Bcl-2蛋白的表達(dá)量則呈下降趨勢(shì)，提示芹菜素可通過(guò)調(diào)控凋亡基因、調(diào)節(jié)參與凋亡的蛋白的表達(dá)等方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。此外，不同濃度的芹菜素處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞24h后，Bcl-2/Bax比值逐漸降低，我們推測(cè)芹菜素可能是通過(guò)降低Bcl-2/Bax比值，誘導(dǎo)線粒體依賴的凋亡途徑，從而實(shí)現(xiàn)其誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的目的。

綜上所述，本研究通過(guò)研究芹菜素對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響，探討芹菜素抗膠質(zhì)瘤作用的可能機(jī)制，以期為中西醫(yī)結(jié)合治療膠質(zhì)瘤提供新的思路和方法。

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作者簡(jiǎn)介：曲曉媛 碩士，副教授。研究方向：腫瘤病理學(xué)。

基金項(xiàng)目：山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目“芹菜素對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87、U251體外抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究”（編號(hào)：2015-200）。

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