核桃黑斑病致病性泛菌的分離鑒定及殼聚糖抑菌的研究

彭子嘉 杜家明 沈闊程 隋韻靜 李 濤 肖永生 余仲東

（1. 西北農林科技大學林學院，陜西 楊凌 712100；2. 通江縣林業(yè)局，四川 通江 636700；3. 四川省森防檢疫站，四川 成都 610082）

核桃是我國重要經濟林樹種[1]，種植面積和產量均位居世界第一，陜西是我國主要栽培區(qū)域之一[2]，面積接近67萬hm2，其中商洛市是陜西省的重要核桃產區(qū)。近年來，核桃產業(yè)為助力“三農”建設起到了重要作用，但核桃頻受病蟲害侵襲，每年造成800 t左右的巨大損失[3]，核桃黑斑病是近年來陜南核桃上的重要病害。核桃黑斑病每年4—8月間由于濕暖的氣候條件，病害發(fā)生較重，可為害果實、葉片、嫩梢、葉柄、頂芽、花器等部位，表現(xiàn)出葉片變黑干枯、果實腐爛脫落等病狀，最終導致核桃嚴重減產[4]。核桃黑斑病普遍認為是黃單胞桿菌屬（Xanthomonassp.）細菌引起，典型的種為油菜黃單胞桿菌核桃致病變種（Xanthomonas campestrispv.juglandis）和樹生黃單胞桿菌核桃致病變種（X.arboricolapv.juglandis）[5-6]，后者在意大利、希臘等歐洲國家有報道。除了上述主要致病菌外，尚存在其他致病病原菌，如胡桃盤二孢菌（Marssonina juglandis）[7-8]。近年來，相關學者分別在意大利、法國、中國山東和甘肅隴南等國家和地區(qū)分離出了成團泛菌（Pantoea agglomerans），并認為該菌可能和核桃頂端褐色壞死、葉片病斑有關[6-7,9]。因此，盡管核桃黑斑病癥狀相似，但確實存在不同氣候區(qū)或者區(qū)域內病原菌可能不同的問題。

由于傳統(tǒng)的農藥防治會對環(huán)境、人畜健康產生一定危害，因此，核桃黑斑病無公害的綠色防治手段越發(fā)受到重視。殼聚糖具有廣譜抗菌性、誘導果實抗病性等功能，對水稻等作物抗逆、抗病蟲害有明顯提升效果[10]；而殼聚糖鹽具有制備方法簡單、使用方便安全、綠色環(huán)保和長期穩(wěn)定等優(yōu)點，具有廣闊應用前景[11]。但是，殼聚糖價格昂貴，抑菌效果在不同病原菌種中有所不同，需要進行濃度優(yōu)化[12]。本研究對陜南地區(qū)感病的核桃果實及枝條樣品進行了病原分離，并對所分離的病原細菌進行致病性測定、形態(tài)觀察、16S rDNA和gyrB基因序列分析和殼聚糖抑菌試驗，以確定陜南地區(qū)核桃黑斑病病原菌種類及防治方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

核桃黑斑病病果、病枝采自陜西南部山陽、商南、丹鳳、商州等縣區(qū)；供試的殼聚糖鹽酸鹽（pH 5.6）、殼聚糖乳酸鹽（pH 6.1）均購自浙江金橋藥業(yè)。

1.2 病原菌的分離

采用組織分離法和組織懸液法進行病菌分離[13]。組織分離法是將獲得的病組織置于PDA平板上，每皿放3片組織塊；組織懸液法是將獲得的組織懸液在LB平板（胰化蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，1 000 mL水，pH 7.2）上劃線，25 ℃下黑暗培養(yǎng)72 h后，挑取其中優(yōu)勢菌落進行劃線培養(yǎng)，獲得單菌落純培養(yǎng)物。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 致病性測定

根據柯赫氏法則，選取枝條頂部的第2～3片葉片、20 d果齡的青果及嫩枝（15 cm）若干，經清水和無菌水清洗，再用70%乙醇表面消毒后備用。葉片接種菌株采用微針刺法。在無菌培養(yǎng)皿（9 cm×9 cm）中放入無菌濾紙，加入1 mL無菌水以濕潤濾紙，將葉片平整置于皿內，使葉柄基部緊貼濾紙以吸收水分；用帶菌注射器針頭輕輕刺傷葉表接種，接種濃度為1×106cfu/mL。以微刺傷接種無菌水和直接噴菌液接種作為對照，每個菌株設6組重復，培養(yǎng)皿用封口膜密封，于溫室中25 ℃、每天12 h連續(xù)光照培養(yǎng)。癥狀出現(xiàn)后按1.2中的方法再次分離病原菌。青果接種，將培養(yǎng)皿換成透明塑封袋（15 cm×7 cm），其余操作與上述葉片接種一致。嫩枝接種前將嫩枝上的葉片修剪干凈，放入無菌培養(yǎng)皿中（16 cm×16 cm），在皿中的無菌濾紙上加入2 mL菌懸液（1×106cfu/mL），對照組加2 mL無菌水，其余操作也與葉片接種一致，每處理6個重復。

1.3.2 形態(tài)觀察、革蘭氏染色及過氧化氫酶活性測定

針對在回接試驗中表現(xiàn)出病害典型癥狀的菌株，進行形態(tài)觀察、革蘭氏染色及過氧化物酶活性的測定。形態(tài)觀察利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（S-4800 SEM，Hitachi，Tokyo，日本）進行[14]；革蘭氏染色及過氧化物酶活性的測定，參照方中達[13]所述方法進行。

1.3.3 菌株的分子鑒定

1）病原細菌總DNA的提取。待測菌株用LB液體培養(yǎng)基于28 ℃搖床（160 r/min）培養(yǎng)48 h，在轉速8 000 r/min下離心1 min后進行菌體收集。采用DNA快速抽提試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司，B518225-0050）提取細菌基因組DNA。

2）病原菌16S rDNA與gyrB基因序列測定。根據細菌16S rDNA的通用引物27F/1492R進行PCR擴增[15]，反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。此外，根據細菌gyrB基因引物F1/R1進行PCR擴增[16]，反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min[1]。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成?？偡磻w積為25 μL，其中2×Es Taq MasterMix（Dye）（北京康為生物科技有限公司）12.5 μL，引物各1 μL，DNA底物2.5 μL，dd H2O 8 μL。反應完成后，取3 μL產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3）PCR擴增產物測序和分析。純化后的PCR產物由北京奧科生物科技有限公司進行雙向測序；用軟件Bioedit 7.2.5對序列修訂和拼接后，利用blastn軟件在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）網站上進行序列同源性比對，下載模式菌株的同源序列；用軟件Clustalx 1.81將所有序列對齊，再用軟件MEGA 5.0分別構建基于16S rDNA和gyrB基因序列的鄰接系統(tǒng)發(fā)育樹，自展法（bootstrap）循環(huán)抽樣檢測1 000次[17-19]。

1.4 殼聚糖鹽溶液抑菌濃度的篩選

1.4.1 最低抑菌濃度范圍篩選

在5 mL蒸餾水中加入0.1 g殼聚糖鹽酸鹽，攪拌溶解（原濃度20 g/L），121 ℃高溫濕熱滅菌20 min。3排無菌試管每排10管，編號1～10。采用倍比稀釋法，向1～9號管管中依次加入5 mL終濃度為10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078、0.039 g/L的殼聚糖鹽酸鹽溶液，在10號管中加入5 mL無菌水。在1～10號試管中分別加入0.1 mL菌液（濃度1×106cfu/mL），10號管作為對照，參照馮小強等[20]的方法將所有接種管置于28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)72 h，在紫外分光光度計（UV-5200，日本島津）OD600下測定菌液濃度，空白液為無菌水，OD值為0即為殼聚糖最低抑菌濃度。對殼聚糖乳酸鹽的最低抑菌濃度篩選方法同上。

1.4.2 最低抑菌濃度的確認

在確定抑菌濃度范圍后，對下限濃度采用瓊脂擴散法確定有效最低抑菌濃度。首先按倍比稀釋法配置各濃度梯度殼聚糖鹽溶液4 mL，并加入0.5 mL菌液（含菌量1×106cfu/mL）搖勻。取混合液1 mL于平皿內，倒入45 ℃的LB培養(yǎng)基（胰化蛋白胨10 g，酵母膏5 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，水1 000 mL，pH 7.2），邊倒邊混勻，3次重復。此外，再設2份對照平皿，一份直接倒入LB培養(yǎng)基，作為陰性對照；另一份加入含0.5 mL/L相同濃度菌液的LB培養(yǎng)基，作為陽性對照。置培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)（28 ℃，72 h）后觀察。以平板中無菌落生長培養(yǎng)皿的殼聚糖鹽濃度為抑菌最低濃度[21]。

2 結果與分析

2.1 菌株致病性測定

從病果、病枝中共分離和純化出不同特征的細菌單菌落6個，分別命名為菌株HB、HC、HD、HE、HF、HG，HB在山陽、丹鳳、商州均有發(fā)現(xiàn)，分離率最高，均在95%以上。

采用微刺法接種各單菌落實驗表明，HB的6個接種葉片中有5個在3 d后葉表出現(xiàn)水漬狀黑色大斑（圖1a）；6 d后病斑逐漸擴大延伸、連結成片、顏色變深，病狀不受葉脈限制，接種處有菌膿出現(xiàn)（圖1c），HC的1個接種葉片有輕微的褪綠狀；其余30個接種葉片均不發(fā)?。粚φ战M葉片沒有發(fā)病癥狀（圖1b，d）。

HB的6個接種青果7 d后果實表面產生明顯的褐色小斑點（圖1e）；接種14 d后果實表面的褐色斑點擴大連片、形成凹陷（圖1g）；其余5個菌株的30個接種青果不發(fā)??；而對照組青果沒有表現(xiàn)出癥狀（圖1f，h）。

HB的4個接種嫩枝5 d后，傷口部位出現(xiàn)褐色小斑且失綠（圖1i）；接種10 d后出現(xiàn)大面積斑點且失水萎蔫（圖1k）；其余32個接種嫩枝出現(xiàn)不同程度萎蔫狀；對照組嫩枝沒有斑點，沒出現(xiàn)明顯的感病癥狀（圖1j，l）。

6個供試菌株中只有HB具有明顯的致病性，發(fā)病癥狀和田間癥狀高度相似。從人工接種發(fā)病的葉片、果實、枝條重新進行病原菌組織分離，均得到類似HB的菌落。其余菌株無分離物出現(xiàn)。實驗表明：HB菌株具有致病性，可從傷口侵入，3 d即發(fā)病，能侵染和為害核桃的果實、嫩枝、葉片，形成典型黑斑癥狀。

圖 1 菌株HB回接核桃的發(fā)病癥狀Fig. 1 Symptoms on walnut inoculated by the isolate HB

2.2 菌株HB的形態(tài)特征

在LB培養(yǎng)基上，菌株HB菌落為圓形，表面濕潤，光滑有光澤，邊緣整齊；稍凸起，粘稠狀，黃色半透明（見圖2a）。菌株呈短桿狀，菌體大小為（0.35～0.5）μm×（0.6～1.0）μm，鞭毛周生，菌體二分裂繁殖（圖2b）。革蘭氏染色為陰性，過氧化氫酶活性呈陽性。

圖 2 菌株HB的菌落特征及掃描電鏡圖片F(xiàn)ig. 2 Colony characteristics and SEM photographs of isolate HB cells

2.3 菌株HB的分子系統(tǒng)學鑒定

16S rDNA PCR擴 增 得 到 的 片 段 長 度 約 為1.5 kb，序列blast搜索結果顯示，序列同源性較高的都是泛菌屬細菌。選取并下載GenBank中與菌株HB同源性較高的模式菌株的序列，構建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，菌株HB的遺傳距離與歐文氏桿菌（Erwinia typographi）遠，與泛菌屬細菌近，但不能區(qū)分泛菌屬種間差異（圖3）。

圖 3 基于16S rDNA基因的菌株HB的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogentic tree of 16S rDNA gene sequences of HB by the neighbor joining

由于16S rDNA基因對親緣關系較近的細菌不能準確鑒定種間關系，為進一步確認菌株HB的系統(tǒng)發(fā)育地位，繼續(xù)進行gyrB基因的PCR擴增，得到一條約1.2 kb的DNA片段。blast結果顯示，泛菌屬與菌株HB高度同源，菌株HB與P.agglomerans（CP014129）、P. vagans（CP002206）同源性都達到97%，而與其他序列的同源性及覆蓋率都較低。選擇GenBank中與菌株HB相似度較高模式菌株構建gyrB基因序列的NJ系統(tǒng)樹表明，菌株HB與模式菌株P.vagans聚在一個單獨的單系分支上而與其他泛菌區(qū)分開，泛菌屬種間關系在gyrB系統(tǒng)樹中被較好地得到了區(qū)分（圖4）。

2.4 菌株HB的抑制實驗

在殼聚糖鹽溶液抑菌試驗中，殼聚糖鹽酸鹽在2.5～5 g/L的濃度范圍內可以抑制菌株HB的生長，當濃度為5 g/L時，試管中液體澄清，OD600為零，同陰性CK；2.5 g/L時，試管中液體呈現(xiàn)輕度渾濁（OD600=0.96）；低于2.5 g/L時，試管中液體隨濃度降低，逐漸渾濁，菌體沉淀增多。確認最低抑菌濃度試驗中，設定殼聚糖鹽酸鹽濃度梯度依次為5.0、4.5、4.0、3.5、3.0、2.0、1.0、0 g/L。實驗結果表明，殼聚糖鹽酸鹽濃度為3.5 g/L時，平皿內沒有菌株HB的菌落生長；而濃度為3.0 g/L時，平皿內生長有3～4個病原菌菌落，結果見表1。當濃度低于3.0 g/L后，隨著濃度的逐漸降低，平皿內菌落數逐漸增加，菌落也越密集?？芍?，殼聚糖鹽酸鹽抑制菌株HB生長的最低濃度為3.5 g/L。

圖 4 基于gryB基因的菌株HB的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogentic tree of gryB gene sequences of HB by the neighbor joining

表 1 殼聚糖鹽酸鹽和殼聚糖乳酸鹽對菌株HB最低抑菌濃度的確定Table 1 Confirmatory test of CH/CL minimal inhibitory concentration to isolate HB

殼聚糖乳酸鹽抑制HB生長的濃度范圍為0.625～0.313 g/L，為確認最低抑菌濃度，設定濃度梯度依次為0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0 g/L。結果表明，殼聚糖乳酸鹽抑制菌株HB生長的最低濃度為0.5 g/L，結果見表1。

實驗結果表明，殼聚糖鹽酸鹽、乳酸鹽對HB菌株均有一定的抑制作用。在相同濃度條件下，含殼聚糖乳酸鹽的試管菌體沉淀少于含殼聚糖鹽酸鹽的試管，液體OD600更低。同時，最低抑菌濃度確定實驗證明，殼聚糖乳酸鹽的最低抑菌濃度（0.5 g/L）顯著低于殼聚糖鹽酸鹽（3.5 g/L）。因此，利用殼聚糖乳酸鹽對該病原菌進行防控的效果比殼聚糖鹽酸鹽更好，殼聚糖乳酸鹽可以在用量更少的情況下滿足防治要求。

3 結論與討論

核桃黑斑病病原種類較多，有真菌性的[6,8]，也有細菌性的[6]。對細菌引起的核桃黑斑病，通常認為病原是樹生黃單胞桿菌核桃致病變種。但從北京、甘肅隴南核桃黑斑病樣品中分離到了油菜黃單胞桿菌（X. campestris）[4-5]。此外，成團泛菌也被證明是核桃黑斑病的伴生病原菌之一，相比黃單胞桿菌屬細菌，在一定時期內其感染速度更快、侵染能力更強、危害更大，是核桃幼果早期變黑脫落的主要原因[6-7,22]。本研究從陜南地區(qū)核桃黑斑病樣本上分離到的菌株中只有最后泛菌是致病的，它與Xanthomonas屬細菌同源性低，與Pantoea屬細菌的同源性高，均為革蘭氏陰性，能產生過氧化物酶，有鞭毛周生等同屬的特征；但gyrB分析顯示HB與成團泛菌不同（圖5），與最后泛菌模式菌株在97%的同源性下聚在一個單系分支上。因此，綜合致病性、形態(tài)特征和16S rDNA、gyrB分析結果，將陜南核桃黑斑病原菌歸屬為最后泛菌的一個致病型。致病性測定表明，最后泛菌可以通過外部傷口侵入核桃果實、葉片、嫩枝等組織，形成典型的黑斑病癥狀。最后泛菌與成團泛菌在致病性上存在一定差異：與成團泛菌最快24 h可出現(xiàn)明顯病斑相比[7]，最后泛菌最快需要近3 d（圖1）；此外，成團泛菌主要依靠感染葉部傷口的方式實現(xiàn)傳播，暫未發(fā)現(xiàn)莖干損傷會導致突出的感染癥狀，因此莖干處傷口不會提高病原菌的傳播風險[7]；而本研究發(fā)現(xiàn)最后泛菌可對核桃嫩枝實現(xiàn)侵染且癥狀明顯，導致嫩枝出現(xiàn)大面積斑點及失水萎蔫，但嫩枝的感染率不如葉片、果實高。

泛菌是一類廣泛分布的植物病原細菌[23]。從河北玉米中分離出的分散泛菌（P. dispersa）和菠蘿泛菌（P. ananatis），均可引起玉米植株葉鞘枯死卷曲，葉脈處出現(xiàn)黃色病斑，莖稈處產生黃褐色干腐[24]。在廣東香蕉葉鞘腐病中分離到成團泛菌，可導致葉鞘變褐腐爛、植株凋萎枯死[25]。本文首次報道了最后泛菌是引致陜南地區(qū)核桃黑斑病的病原。

對于傳統(tǒng)核桃黑斑病的防治，常見的農藥有農用鏈霉素、石硫合劑等；對成團泛菌所引起的核桃黑斑病，有研究表明百菌清[22]、中生菌素、噻霉酮、氟啶胺和春雷霉素等藥劑[26]均有較好的抑菌作用。但是，農藥防治手段會造成農藥土壤殘留，對人畜健康也會造成一定危害。殼聚糖廣泛存在于自然界中，是為數不多原料充足的可再生資源之一；其簡單改性后得到的殼聚糖鹽酸鹽及乳酸鹽，具備良好的廣譜抑菌性、水溶性、成膜性、生物相容性以及生物降解性等諸多優(yōu)越特性，且制備方便、使用簡單、具有一定保健功能，可在食品、果蔬保鮮、以及防控細菌病害中發(fā)揮重要作用[10-11]。本研究表明水溶性殼聚糖鹽能有效防治由最后泛菌引起的核桃黑斑病，作為果面保護劑，具有阻隔、抑菌效果（田間數據未公布），應用潛力大[27]；但還缺乏深入系統(tǒng)研究，今后應著重對殼聚糖分子結構與抑菌機理、各類殼聚糖衍生物的抑菌活性及效果、不同溶劑和酸堿性等條件對殼聚糖產物抑菌作用的影響，以及殼聚糖在病害防治方面的綜合應用技術等方面開展研究[10,28]，以期為制定完整規(guī)范的核桃黑斑病無公害防治體系和方案提供依據。