牛樟芝羊毛甾醇合成酶基因AcLSS的克隆和表達分析

鄭 元 羅婭娜 羅瑪妮婭 張 璋 王 毅

（1. 云南省林業(yè)和草原科學院，云南 昆明 650201；2. 西南林業(yè)大學林學院，云南 昆明 650233）

在真核生物中，氧化角鯊烯環(huán)化酶家族（OSCs）可催化2,3-氧化角鯊烯（OS）發(fā)生不同類型的環(huán)化作用，在動植物和真菌中分別合成麥角甾醇和膽固醇以及植物甾醇等不同碳架的三萜類化合物[1]。在真菌三萜化合物的合成過程中，角鯊烯合成酶（SQS）、角鯊烯環(huán)氧酶（SE）和羊毛甾醇合成酶（LSS）都是影響其生物合成的關(guān)鍵酶。第1步，由SQS將異戊二烯通路中的碳通量引至三萜生物合成通路，催化2分子法呢基焦磷酸（FPP）縮合產(chǎn)生角鯊烯；第2步，由SE催化角鯊烯合成三萜和甾醇的共同前體物質(zhì)OS；第3步，由羊毛甾醇合成酶（LSS）催化OS經(jīng)一系列的環(huán)化反應生成四環(huán)結(jié)構(gòu)的羊毛甾醇；最后，由麥角甾醇合成相關(guān)的一系列酶催化羊毛甾醇最終轉(zhuǎn)化形成麥角甾醇[2]。在這一系列的合成過程中，由LSS催化的OS環(huán)化反應是麥角甾醇和三萜化合物生物合成的關(guān)鍵分支位點，因此通過對編碼2,3-氧化角鯊烯環(huán)化酶或羊毛甾醇合成酶的基因進行調(diào)控，可以調(diào)節(jié)OS最終流向麥角甾醇代謝途徑的比例[3]。目前，羊毛甾醇合成酶基因已在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、粗莖鱗毛蕨（Dryopteris crassirhizoma）[4]、人參（Panax ginseng）[5-6]等多種植物中被分離鑒定，但在牛樟芝（Antrodia cinnamomea）中LSS基因還鮮有報道。

牛樟芝又名牛樟菇，是多孔菌科（Fomitopsidaceae）薄孔菌屬的真菌。常寄生在百年牛樟樹（Cinnamomum kanehirai）腐朽樹干的心材內(nèi)壁或是其潮濕的木材表面，故野生牛樟芝一般難以獲得[7-10]。牛樟芝中含有三萜、多糖、馬來酸衍生物等300多種有效成分，是一種高價值的藥用真菌。其中牛樟芝的三萜化合物具有抗腫瘤、抗病毒、抗過敏、抑制血小板凝集等多種生理活性，同時還可增強免疫力、有效地預防各種心血管疾病[11-18]。本研究對牛樟芝三萜類化合物合成途徑的關(guān)鍵酶基因AcLSS進行克隆，探究不同培養(yǎng)添加物對其表達情況的影響，有利于深入地了解牛樟芝三萜類化合物的合成途徑，為進一步研究其調(diào)控機理提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1）實驗材料：牛樟芝AC001由云南省林業(yè)和草原科學院提供，經(jīng)過ITS鑒定，具體的培養(yǎng)條件和取樣方法參照原曉龍等[19]對牛樟芝actri5基因的克隆與最佳表達培養(yǎng)基的篩選。

2）實驗試劑：RNA提取試劑盒（北京康為世紀有限公司）、HiFi-DNA聚合酶（北京全式金生物技術(shù)有限公司）、引物（AcLSSF0、AcLSSR0、TAcLSSF、TAcLSSR）、載體（pUMT） （上海生工生物工程股份有限公司）；質(zhì)粒提取試劑盒（北京康為世紀有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara Super RT）等。

1.2 AcLSS基因的克隆

對牛樟芝的基因組數(shù)據(jù)進行本地BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）比對，以繡球菌（Sparassis crispa，XP_027617410.1）的LSS基因為探查序列，比對得到目標序列，并在此基礎(chǔ)上根據(jù)目標序列設(shè)計特異性引物AcLSSF0、AcLSSR0（表1）。采用RNA試劑盒（康為世紀，CW0559，https://www.cwbiotech.com/goods/index/id/10205）提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成一鏈cDNA，具體方法參見說明書；以cDNA為模板，AcLSSF0、AcLSSR0為引物進行PCR擴增。對擴增體系進行檢測并取目的條帶，目的條帶經(jīng)回收純化后連接到pUMT載體上，采用菌落PCR技術(shù)進行篩選，將陽性克隆提取質(zhì)粒后送往上海生工生物工程股份有限公司進行雙向測序。

表 1 克隆體系的引物序列Table 1 The primer sequences of clone systems

1.3 AcLSS基因的序列分析

將AcLSS的測序結(jié)果用DNAMAN軟件進行序列拼接，并對其cDNA序列和氨基酸序列從理化性質(zhì)、信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)、細胞定位和功能域等方面進行分析和預測，并選擇同源性較高的真菌LSS蛋白序列進行聚類分析。其中，理化性質(zhì)分析借助于ProParam在線工具（https://web.expasy.org/protparam/），信 號 肽 預 測用SignalP 4.1 server（https://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/），跨膜結(jié)構(gòu)分析用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM），細胞定位采用TargetP（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）分析，保守結(jié)構(gòu)域預測則利用Structure/cdd（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）[10]。

1.4 AcLSS蛋白的系統(tǒng)進化樹分析

將AcLSS蛋白進行BLAST在線比對后，選擇一致性較高的真菌LSS蛋白與其進行多序列比對。采用MEGA7.0的Clustal W程序進行，構(gòu)建系統(tǒng)樹時應用鄰位相接法，在自展分析中重復次數(shù)設(shè)置為1 000次，其他均采用默認參數(shù)進行繪制。

1.5 AcLSS基因的表達分析

選擇適于牛樟芝生長的培養(yǎng)基作為研究AcLSS基因的配方（表2）。分別將牛樟芝菌絲體接種在1～13號培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)40 d后，從各培養(yǎng)基上取適量菌絲體提取總RNA，設(shè)置3次重復。利用總RNA合成cDNA，以actin作為內(nèi)參，以TAcLSSF、TAcLSSR為引物，分別檢測AcLSS在不同水平下的表達情況。檢測結(jié)束后，用GENE-SNAPS分析各條帶的積分光密度值，以此作為相對表達量繪制柱狀圖，對凝膠電泳圖像進行相對定量分析。

表 2 不同添加物的培養(yǎng)基Table 2 The mediums with different additives

2 結(jié)果與分析

2.1 AcLSS基因全長分析

以牛樟芝的cDNA為模板，以AcLSSF0、AcLSSR0為特異性引物，得到牛樟芝羊毛甾醇合成酶基因（AcLSS）的全長cDNA，通過比對其基因組DNA與cDNA序列發(fā)現(xiàn)其含有8個內(nèi)含子（從起始密碼子開始依次為424～471、690～749、885～938、1 572～1 626、1 773～1 821、1 927～1 979、2 202～2 261、2 409～2 469）、9個外顯子（圖1）。AcLSS基因的開放閱讀框為2 205 bp，編碼734個氨基酸殘基。將AcLSS蛋白序列在NCBI上比對發(fā)現(xiàn)，該蛋白與繡球菌（S. crispa，XP_027617410.1）的羊毛甾醇合成酶蛋白的同源性為99%，一致性達80.52%。

2.2 AcLSS基因的生物信息學分析

通過預測AcLSS蛋白序列的理化性質(zhì)可知：分子式為C3824H5753N1017O1076S37；其相對分子質(zhì)量為84.38 kDa，理論等電點（pI）為6.13，主要氨基酸包括Ala、Glu、Gly、Leu等；負電荷氨基酸殘基（Asp + Glu）總數(shù)為82個，正電荷氨基酸殘基（Arg + Lys）為70個；脂肪族系數(shù)為77.07；不穩(wěn)定指數(shù)為45.46，屬于不穩(wěn)定蛋白。AcLSS蛋白不存在信號肽，屬于非分泌蛋白；跨膜結(jié)構(gòu)預測顯示該蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)。將AcLSS蛋白序列在美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）上進行比對，發(fā)現(xiàn)其與繡球菌（XP_027617410.1）、褐腐擔子菌（Postia placenta，XP_024340992.1）、玫瑰色擬層孔菌（Fomitopsis rosea，TFY51879.1）、茯苓（Wolfiporia cocos，ALM02366.1）的LSS蛋白序列一致性分別為80.52%、75.88%、78.61%、79.43%。通過其蛋白序列分析可知，該蛋白存在由14個氨基酸和6個氨基酸組成的高度保守序 列“KGAWPFSTKTQGYT”、“VSDCTG”，以及由16個氨基酸組成的OSC保守結(jié)合域“KACNFLISKQRSDGGW”（圖2）。

圖 1 AcLSS基因的內(nèi)含子和外顯子Fig. 1 The introns and exons of AcLSS gene in A. cinnamomea

圖 2 牛樟芝LSS蛋白與其他真菌LSS蛋白序列比對分析Fig. 2 The proteinic sequences alignment of LSS in A. cinnamomea with other related fungus proteins

2.3 AcLSS蛋白分子系統(tǒng)進化

將牛樟芝AcLSS蛋白與其他11條真菌LSS蛋白序列進行多序列比對后，繪制出分子系統(tǒng)進化樹（圖3）。結(jié)果顯示：松生擬層孔菌（Fomitopsispinicola，EPT00921.1）、櫟迷孔菌（Daedalea quercina，KZT70711.1）、根纖維孔菌（Fibroporia radiculosa，XP_012179653.1）、硫 磺 多 孔 菌（Laetiporus sulphureus，KZT09915.1）、擬 蠟 菌（Obba rivulosa，OCH91004.1）、蟲 擬 蠟 菌（Gelatoporia subvermispora，EMD38881.1）等多孔菌科的真菌聚為一支；（Hydnomerulius pinastri，KIJ65724.1）、干 腐 菌（Serpula lacrymans，XP_007320669.1）、褐腐擔子菌（P. placenta，XP_024340992.1）、牛 樟 芝（A.cinnamomea）等真菌聚為一支；紫蠟蘑（Laccaria amethystina，KIK07789.1）和乳白蛋巢菌（Crucibulum laeve，TFK39425.1）聚為一支。其中，牛樟芝與褐腐擔子菌的AcLSS蛋白親緣關(guān)系最近。

圖 3 牛樟芝AcLSS蛋白與其他真菌相關(guān)蛋白序列的系統(tǒng)進化樹Fig. 3 The phylogenetic tree of AcLSS in A. cinnamomea with other related LSS proteins in different fungi

2.4 AcLSS基因的表達水平檢測

以肌動蛋白為參照，以TAcLSSF、TAcLSSR為引物，分別檢測AcLSS基因在不同培養(yǎng)基上的表達情況，誘導表達結(jié)果顯示：在不同的培養(yǎng)條件下，AcLSS基因的表達量差異顯著。以甘露醇為碳源和番茄浸粉為氮源時，該基因的誘導表達量最高（圖4）。

圖 4 不同添加物對AcLSS的誘導表達Fig. 4 The inducible expression of AcLSS gene in A. cinnamomea cultivated in different additives

3 結(jié)論與討論

牛樟芝中的三萜類化合物作為一類次級代謝產(chǎn)物，是通過甲羥戊酸（MVA）代謝途徑，經(jīng)羊毛甾醇等中間體，經(jīng)過一系列氧化還原以及環(huán)化反應形成的。羊毛甾醇合成酶是OSC家族的一個重要成員，在MVA途徑中的第2個分支點上發(fā)揮重要作用，是牛樟芝三萜類化合物合成過程中的一個關(guān)鍵酶。羊毛甾醇合成酶可催化2,3-氧化鯊烯環(huán)化生成羊毛甾醇，其含量以及活性的高低會影響麥角甾醇的產(chǎn)量，而麥角甾醇和羊毛甾醇是牛樟芝三萜化合物的兩種主要骨架，占據(jù)總?cè)平Y(jié)構(gòu)比例的63%[20]。

本研究對牛樟芝AcLSS基因的理化性質(zhì)、細胞定位和跨膜結(jié)構(gòu)等方面的研究結(jié)果與前人基本一致。通過蛋白比對發(fā)現(xiàn)AcLSS蛋白存在由14個氨基酸和6個氨基酸組成的高度保守特征序 列“KGAWPFSTKTQGYT”、“VSDCTG”，以及由16個氨基酸組成的OSC保守結(jié)合域“KACNFLISKQRSDGGW”。由此可見，羊毛甾醇合成酶基因及其功能蛋白在整個分子進化過程中高度保守。分子系統(tǒng)進化分析結(jié)果顯示，AcLSS蛋白與褐腐擔子菌的LSS蛋白親緣關(guān)系最近；表達譜結(jié)果顯示，不同碳、氮源添加物對牛樟芝AcLSS基因的誘導表達量差異明顯。在不同碳源中，誘導表達量依次為甘露醇＞果糖＞葡萄糖；不同氮源中，則表現(xiàn)為番茄浸粉＞土豆蛋白胨＞酵母提取物。趙能等[21]研究發(fā)現(xiàn)牛樟芝菌絲體在不同碳、氮源添加物的培養(yǎng)基上菌絲體的長勢和形態(tài)上存在較大差異，表明牛樟芝對不同碳氮源添加物的利用范圍較廣，但在利用效率上差異明顯。原曉龍等[22]對牛樟芝3-羥-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因進行誘導表達，發(fā)現(xiàn)在添加不同碳源的培養(yǎng)基上，表達量依次為果糖＞甘露醇＞乳糖；在不同氮源添加物的培養(yǎng)基上，誘導表達量依次為酪蛋白胨＞土豆蛋白胨＞牛肉浸粉。結(jié)合本研究的結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，碳源添加物中的甘露醇和果糖以及氮源添加物中的土豆蛋白胨的誘導表達力一直保持較好的水平，這也為未來通過調(diào)節(jié)特定化合物含量來誘導目的基因過表達的工作提供切實的參考。

近年來，隨著牛樟芝良好的藥理作用被不斷地研究和挖掘，其人工培養(yǎng)技術(shù)在福建、云南、江西、浙江、遼寧等地逐漸興起。人工培養(yǎng)的主要方法有椴木栽培法、固體培養(yǎng)法、液體發(fā)酵法和皿培法。不同的培養(yǎng)方法對牛樟芝中化學成分的含量和種類有一定影響。其中，椴木培養(yǎng)法所獲得的產(chǎn)物與野生牛樟芝成分最為相似，但由于其培養(yǎng)周期較長，未被廣泛采用；另外3種培養(yǎng)方法因周期短、產(chǎn)率高等優(yōu)勢已得到推廣應用[23]。然而，在自然條件下，牛樟芝的生長十分緩慢，而又因其含有較多的活性物質(zhì)，一度造成供不應求的市場現(xiàn)狀。本研究通過對牛樟芝三萜類化合物MVA合成途徑中的關(guān)鍵限速酶基因AcLSS進行克隆以及探究其在不同碳氮源培養(yǎng)基上的表達情況，以期為牛樟芝三萜化合物合成酶表達機制的研究提供參考；同時，為異源表達提取牛樟芝三萜化合物的工作奠定基礎(chǔ)，通過對特定基因的誘導，明確能夠增加最終產(chǎn)物的化合物，最終達到增加下游三萜化合物產(chǎn)量的目的。