多黏類芽胞桿菌PaenibacillUS poZymyxa菌株P(guān)1防治黃瓜霜霉病的研究

葉乃瑋 王承芳 干華磊 吳紫燕 糜芳 毛偉力

關(guān)鍵詞黃瓜霜霉病;室內(nèi)藥效;田間藥效測試;多黏類芽胞桿菌;生防菌

黃瓜Cucumis sativus L是一種重要的經(jīng)濟作物，全球每年產(chǎn)量高達8300萬t。霜霉病、白粉病和角斑病是黃瓜生產(chǎn)上最為嚴重的3種病害，其中由古巴假霜霉Pseudoperonospora cubensis引起的霜霉病最具毀滅性，可導致30%左右的減產(chǎn)，病情嚴重時可造成50%～70%的減產(chǎn)，甚至是絕收。目前，防治黃瓜霜霉病主要依靠化學藥劑，但由于霜霉的侵染能力極強，在適合的環(huán)境條件下，病害可頻繁連續(xù)發(fā)生，迫使化學農(nóng)藥的使用頻率增加，進而加快了病原菌對多種化學農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的速度。同時，長期使用化學農(nóng)藥會造成食品安全、環(huán)境污染及高殘留等問題。

為了降低化學農(nóng)藥的使用頻率，提高對環(huán)境和食品安全的保護力度，許多研究者嘗試用植物提取液、微生物和生物誘抗劑等生物制劑防治黃瓜霜霉病。生物防治對環(huán)境友好，不易產(chǎn)生抗藥性，在黃瓜的安全生產(chǎn)中可起到重要作用。王玉全選用中草藥制劑ZY、苯丙噻二唑BTH和側(cè)柏葉提取液CB3種藥劑進行盆栽試驗評估對黃瓜霜霉病的防效，其中側(cè)柏葉提取液CB的效果最佳（61.6%）。張淑梅等分離得到1株在葉面有較強定殖能力的枯草芽胞桿菌ZH-8，對黃瓜霜霉病的室內(nèi)防效為75.61%。李星等研究發(fā)現(xiàn)枯草芽胞桿菌Z-X-3和Z-X-10對黃瓜霜霉病有預防和治療效果。鄭麗等用青枯菌的Harpin蛋白PopW誘導黃瓜獲得系統(tǒng)抗性抵抗霜霉病，溫室防效達42.85%，并能增加黃瓜生物量26.92%。本研究通過離體葉片法篩選得到1株對黃瓜霜霉病原菌有較強抑制作用的多黏類芽胞桿菌P.polymyxa P1，通過室內(nèi)生測和田間藥效試驗測定P1菌株對黃瓜霜霉病的防治效果。

1材料與方法

1.1供試材料

生防菌：30株生防細菌，由上海萬力華生物科技有限公司分離、保存。

供試黃瓜：品種為‘顏如玉，沈陽市九農(nóng)高科種苗有限公司生產(chǎn)。

試驗藥劑：2×10cfu/mL P1懸浮劑（P1-SC），上海萬力華生物科技有限公司;250g/L嘧菌酯懸浮劑（SC），先正達南通作物保護有限公司。

1.2生防菌菌液制備

用接種針分別將培養(yǎng)于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）平板上的30株生防菌接種至裝有100mL營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，置于30℃，180 r/min搖床上培養(yǎng)48h。用Petrroff-Hauser細菌計數(shù)板將30株生防菌發(fā)酵液分別稀釋成1×10cfu/mL的菌體懸浮液備用。

1.3霜霉病菌孢子囊懸浮液制備

采集黃瓜霜霉病葉，清水沖凈，置于含有2層濕濾紙片的培養(yǎng)皿中，在24℃保濕培養(yǎng)24h，促進其產(chǎn)生新的孢子囊。用無菌水沖洗霉層收集孢子囊，通過2層紗布過濾雜質(zhì)，加無菌水稀釋后配制成1×10cfu/mL孢子囊懸浮液備用。

1.4離體葉片法篩選

在盆栽黃瓜苗上選擇相同葉位、長勢一致的葉片，從葉柄1～2cm處剪下，用濕脫脂棉包裹葉柄，將葉片在1.2制備的30株生防菌菌液中各自充分浸潤30s，瀝去多余菌液，待藥液被吸收干后，將各處理葉片葉背向上，按處理標記排放在培養(yǎng)皿內(nèi)，并置于支架上培養(yǎng)24h，用喉頭噴霧器噴頭（壓力0.1MPa）將霜霉病菌孢子囊懸浮液接種至黃瓜葉片背面，然后在培養(yǎng)皿內(nèi)加9mL無菌水，設置病原對照和無菌空白培養(yǎng)對照，每個處理3片葉，3次重復。加蓋保濕22℃培養(yǎng)5 d后調(diào)查發(fā)病情況。

1.5生防菌株P(guān)1的鑒定

生理生化鑒定：生防菌株P(guān)1參考《常見細菌鑒定手冊》進行顯微鏡形態(tài)觀察、革蘭氏染色、芽胞染色以及厭氧生長試驗、接觸酶試驗、氧化酶等生理生化項目測定。

分子鑒定：采用CTAB法提取菌株基因組DNA，擴增其16S rDNA序列。采用通用引物進行序列擴增。正向引物27F（5，-AGAGTTTGATC-CTGGCTCAG-3）;反向引物1492R（5-ACGGC-TACCTTGTTACGACT-3）。PCR擴增產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST分析，采用MEGA 5.0軟件neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，根據(jù)菌株間的親緣關(guān)系確定菌株P(guān)1的種屬。

1.6室內(nèi)藥效生測

挑選4葉期長勢一致的‘顏如玉黃瓜苗移栽至營養(yǎng)缽（直徑10cm），缽內(nèi)裝有3/4的營養(yǎng)土（草炭：蛭石：珍珠巖=7：2：1）。先將試驗藥劑P1-SC配制成5個濃度：2.0×10、7.8×10、3.12×10、1.25×10、5×10cfu/mL?；瘜W對照藥劑：250g/L嘧菌酯SC125mg/L。再用喉頭噴霧器噴頭（壓力0.1MPa）將藥液均勻噴施于葉片兩面至全部潤濕，4次重復，設清水為空白對照。噴藥后24h進行病原接種（方法同1.4），然后將黃瓜苗移至溫室（20～22℃）保濕箱中，RH 90%以上條件下培養(yǎng)。

待空白對照充分發(fā)病，調(diào)查各處理每株黃瓜苗病斑數(shù)，根據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)，計算各處理的防治效果。防治效果=（對照病斑數(shù)一處理病斑數(shù)）/對照病斑數(shù)×100%。

1.7田間藥效測試

田間藥效試驗在上海浦東張江鎮(zhèn)卉綠農(nóng)場（2017年-2018年）進行，品種為‘顏如玉。試驗設5個處理，均為制劑用量。P1-SC 1500、2250mL/hm2和3000 mL/hm2，250g/L嘧菌酯SC600mL/hm2，空白對照。黃瓜霜霉病病發(fā)初期開始用藥，后續(xù)每隔7d施用1次，連施3次。采用春豐8HA電動噴霧器對黃瓜進行莖葉噴霧施藥，用水量為750L/hm2。每處理試驗面積為20m2，4次重復，各處理隨機排列。末次用藥7d后，統(tǒng)計病情指數(shù)并計算防效，病指調(diào)查與防效計算方法參考文獻。

1.8數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)使用Excel整理，采用SPSS20.0對數(shù)據(jù)進行單因素ANOVA分析。

2結(jié)果與分析

2.1離體葉片法篩選結(jié)果

離體葉片篩選結(jié)果（表1）表明，經(jīng)B-09、B-12、P1和P7菌液處理的黃瓜葉片，病斑數(shù)量都少于其他菌液及病原對照處理的葉片，其中經(jīng)P1處理的葉片未出現(xiàn)病斑。

2.2菌株P(guān)1鑒定結(jié)果

經(jīng)對菌株P(guān)1進行生理生化測試，鑒定結(jié)果（表2）表明，P1是1株能產(chǎn)生芽胞的桿狀革蘭氏陽性細菌，結(jié)合16S rDNA序列分析（圖1）菌株P(guān)1為多黏類芽胞桿菌Paenibacillus polymyxa。

2.3室內(nèi)藥效測試結(jié)果

結(jié)果（表3）表明，P1-SC對黃瓜霜霉病的防治效果與用藥濃度呈正相關(guān)。當使用濃度為1.25×10cfu/mL時，P1-SC對霜霉病的防治效果與化學農(nóng)藥250g/L嘧菌酯SC相似;當使用濃度為5.0×10cfu/mL時，防治效果顯著大于（P≤0.05）嘧菌酯。

2.4大田藥效測試結(jié)果

連續(xù)兩年大田藥效測試結(jié)果（表4）表明。經(jīng)P1-SC處理（2250mL/hm2）的黃瓜植株霜霉病病情指數(shù)（4.65，6.00）和防治效果（74.53%，75.66%）分別與經(jīng)250g/L嘧菌酯SC（600 mL/hm2）處理的植株（4.33、6.22;76.30%、74.95%）相似。而經(jīng)P1-SC（3000mL/hm2）處理的黃瓜植株霜霉病病情指數(shù)（2.53，2.48）和防治效果（86.16%，89.90%）分別顯著低于或高于經(jīng)250g/L嘧菌酯SC（600mL/hm2）處理的植株（P≤0.05）。

3討論

作為一種生防菌，多黏類芽胞桿菌已在綠色和有機農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛的應用。多黏類芽胞桿菌對作物和環(huán)境都安全，已被美國環(huán)境保護署（EPA）列為可商用的微生物種類之一。該菌對水稻惡苗病菌Fusarium monili forne、人參黑斑病菌Alternaria panax、棉花黃萎病菌Verticilliumdahliae和番茄青枯病菌Ralstonia solanaceayum等病菌有良好的拮抗效果，但是，應用在黃瓜霜霉病上的研究還鮮有報道。本研究結(jié)果顯示，P1-SC對黃瓜霜霉病菌有較強的抑菌效果，P1能定殖在黃瓜葉片上，抵御或殺死霜霉病菌。

隨著黃瓜種植面積的擴展和農(nóng)藥使用次數(shù)的增加，霜霉病菌對化學農(nóng)藥的抗性問題日益嚴重，已被殺菌劑抗性行動委員會（FRAC）歸屬為高抗藥性風險病原菌。孟潤杰等研究發(fā)現(xiàn)河北省不同地區(qū)的838株黃瓜霜霉病菌對化學農(nóng)藥甲霜靈和嘧菌酯的抗性頻率為100%，抗性倍數(shù)分別為482.99和354.94倍。路粉等通過葉盤漂浮法檢測了2011年一2016年河北、山東2地1821個霜霉病菌對烯酰嗎啉和雙炔酰菌胺的抗藥性，抗性頻率分別為88.5%和34.3%。然而多黏類芽胞桿菌主要是通過與病原菌競爭生存空間和營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生抗生素以及多黏菌素和各種水解酶等抑菌物質(zhì)，誘導植物獲得系統(tǒng)抗性等途徑實現(xiàn)對植物病害的防治。P1-SC對植物病害的防治效果獨特，具多重作用機制（拮抗作用、形成生物菌膜等），病原菌難以產(chǎn)生抗藥性，而且其選擇性高，對環(huán)境安全，是解決黃瓜霜霉病菌抗性問題的首選。本研究室內(nèi)及兩年田間藥效試驗表明，當P1-SC的用藥劑量為3000 mL/hm2時對黃瓜霜霉病的防效優(yōu)于250g/L嘧菌酯SC。在黃瓜的安全生產(chǎn)中，P1-SC能減少或代替化學農(nóng)藥的使用，在綠色農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展道路上，有良好的應用前景。