遼寧省北鎮(zhèn)市葡萄葉斑病的病原鑒定

劉梅 王彩霞 燕繼曄 賈靜怡 李興紅

關鍵詞葡萄;葉斑病;多基因系統(tǒng)發(fā)育;平頭炭疽菌

葡萄為葡萄科葡萄屬落葉藤本植物，原產于歐洲和亞洲西部，是世界上種植面積最大的水果之一。我國葡萄產量和種植面積長期位居世界前列。在葡萄栽培過程中，有時會在葉片上出現由真菌侵染形成的大小形狀不一的斑點，具有傳染性，造成葉片局部壞死甚至整片枯黃脫落，對葡萄生產造成不利影響。

目前國內外已經報道的葡萄真菌性葉斑病主要有褐紋病、大褐斑病、小褐斑病、輪斑病、殼針孢葉斑病、環(huán)紋葉枯病、假尾孢葉斑病和尾孢葉斑病、角斑葉焦病、葉枯病、黑痣病、枝孢葉斑病，Neopestalotiopsis vitis、Cladosporium hebeiense引起的葡萄葉斑病，以及由鏈格孢Alternaria alternata、葡萄鏈格孢A viniferae和喬木鏈格孢A.arborescens引起的葡萄葉斑病等。近年來遼寧北鎮(zhèn)葡萄上出現葉斑病癥狀，表現為葉上出現圓形或橢圓形小黑斑，病斑周圍褪綠變黃，影響葉片功能，進而影響果實產量和品質。

為明確引起該病害的病原菌，對病樣進行分離培養(yǎng)，采用多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結合形態(tài)學特征對分離得到的病原菌進行鑒定，以期為該葡萄葉斑病的發(fā)生和防治提供參考。

1材料與方法

1.1材料

供試病樣及寄主：從遼寧北鎮(zhèn)采集出現圓形或橢圓形小型黑色病斑、周圍出現褪綠變黃的葡萄葉斑病病葉15片，帶回實驗室進行組織分離。致病性測定所用‘夏黑葡萄葉片采自北京葡萄與葡萄酒工程技術研發(fā)中心。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20g、瓊脂15～18g，加水定容至1000mL，121℃高壓蒸汽滅菌20min。

試劑及儀器：十六烷基三甲基溴化銨（cetyltri-methylammoniumbromide，CTAB），美國Amresco公司;2×Taq Master Mix和DNA Marker，北京博邁德基因技術有限公司;其他試劑均為國產分析純。Axio Imager Z2顯微鏡，德國Carl Zeiss公司;Bio-Rad Gel DocTM XR+凝膠成像儀、C1000 TouchTMThermal Cycler PCR儀，美國Bio-Rad公司;Ep-pendorf AG 5424離心機，德國Eppendorf公司。

1.2方法

1.2.1病原菌的分離與純化

采用常規(guī)組織分離法對具有典型癥狀的葉片進行分離。首先在病健交界處剪取邊長為5mm的方形組織，用75%乙醇消毒30 s，無菌水清洗3次，晾干后置于PDA平板上，將培養(yǎng)皿置于25℃、L//D=12 h//12h條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用單孢分離法進行菌種純化，將純化菌株編號為JzB330152，并在4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2病原菌的分子生物學鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

采用CTAB法提取菌株的基因組DNA。分別利用rDNA轉錄問隔區(qū)ITS通用引物ITS-4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）/ITS-5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）、3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH基因的引物GDF（5'-GC-CGTCAACGAATIGA-3）幾丁質合酶CHS-1基因的引物CHS-79F（5，-TGGGGCAAG-GATGCTTGGAAGAAG-3）CHS-345R（5-TG-GAAGAACCATCTGTGAGAGTTG-3）、肌動蛋白ACT基因的引物ACT-512F（5，-ATGTG-CAAGGCCGGTTTCGC-3）/ACT-783R（5-TAC-GAGTCCTTCTGGCCCAT-3）微管蛋白TUB2基因的引物BT-2F（5，-GTBCACCTYCAR-ACCGGYCARTG-3'）/BT-4R（5-CCRGAYTGRC-CRAARACRAAGTTGTC-3）進行PCR擴增，引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，PCR產物送至北京博邁德基因技術有限公司進行測序。在NCBI上對測序結果進行BLAST比對分析，在GenBank中下載相關參考序列，利用MAFF）對所有序列進行比對，利用BioEdit 7.0.9.0軟件進行多基因序列整合，而后利用ALTER軟件將文件格式轉換成nexus格式。最后將序列載人PAUP 4.0b10軟件中，用最大簡約法（maximumparsimony，MP）構建系統(tǒng)發(fā)育樹并進行系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.3形態(tài)學觀察

將純化后的菌株在PDA平板上于28℃、L//D=12 h//12h的條件下培養(yǎng)7～10 d，觀察記錄菌落形態(tài)如形狀、顏色、質地等。在顯微鏡下觀察分生孢子、分生孢子盤的形態(tài)特征并測量分生孢子大小，共測量30個分生孢子。

1.2.4致病性測定

選取健康成熟的‘夏黑葡萄葉片，用1%NaCl0表面消毒30 s，無菌水清洗3次，吹干備用。將純化后的菌株在PDA平板上培養(yǎng)7d，用血球計數法配制濃度為1×10個/mL的孢子懸浮液備用。采用滴接法對離體葉片分別進行刺傷和無傷接種。每片葉4個接種點，于主葉脈兩側各2個且對稱，一側刺傷接種，另一側無傷接種，每點接種孢子懸浮液20μL，共處理9片葉，重復3次，以無菌水為空白對照。接種后將葉片置于25℃、相對濕度90%下進行黑暗培養(yǎng)24h，之后在相對濕度65%、光周期L//D=12h//12h條件下培養(yǎng)。觀察并記錄葉片的發(fā)病情況，接種部位出現褐色病斑即為開始發(fā)病，直至出現與田間相似的癥狀時對病斑再次進行組織分離，觀察分離物與接種菌株的形態(tài)特征，完成柯赫氏法則驗證。

2結果與分析

2.1病原菌的分子生物學鑒定

利用ITS、GAPDH、CHS-1、ACT與TUB2共5個基因序列對所得菌株進行PCR特異性擴增，分別得到長度為528、290、249、272 bp和497 bp的片段，以Colletotrichum lindemuthianum CBS144.31作為外群經MP法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示：JZB330152與平頭炭疽菌Colletotrichum truncatum（CBS 151.35）聚在同一支上，自展支持率為100%（圖1）。

2.2病原菌的形態(tài)學特征

PDA培養(yǎng)基上病原菌菌落圓形，邊緣整齊，菌絲較稀疏，緊貼培養(yǎng)基生長，初期菌落邊緣為白色，中心為淺灰色，后期菌落顏色變?yōu)樯詈稚?分生孢子盤黑色堆狀突起;分生孢子呈無色，無分隔，新月或鐮刀形，兩頭鈍尖，大小為（15.32～28.51）μm×（3.33～6.62）μm。依據形態(tài)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，將葡萄葉斑病的病原菌鑒定為平頭炭疽菌Colleto-trichum truncatum（圖2）。

2.3致病性測定

無傷和刺傷接種‘夏黑葡萄葉片，接種后3d均開始發(fā)病，7d病斑逐漸向周邊擴展，病斑顏色變深，成暗褐色。對照葉片未發(fā)病。對發(fā)病葉片再次進行組織分離，分離物與原始分離菌株一致，完成柯赫氏法則驗證（圖3）。

3討論

本研究對采自遼寧省北鎮(zhèn)市的感病葡萄葉片進行了病原菌的分離純化、形態(tài)鑒定、致病性測定及柯赫氏法則驗證。并對病原菌的ITS、GAPDH、CHS-1、ACT與TUB2基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結果顯示，病原菌與平頭炭疽菌Colletotrichum trun-catum模式菌株CBS 151.35聚在同一支上，且自展支持率為100%，結合形態(tài)學特征將引起葡萄葉斑病的病原菌鑒定為C truncatum。

在葡萄的栽培中，炭疽病是一種重要的常見病害，主要為害葡萄果實，一般造成葡萄減產10%～20%，日本、澳大利亞等國家報道引起葡萄果實炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌C gloeosporioides和（或）尖孢炭疽菌C acutatum，國內報道引起葡萄炭疽病的病原菌有膠孢炭疽菌、C viniferum、C fructicola以及C aenigma和C hebeiense，2016年筆者在湖北發(fā)現引起‘紅地球葡萄嫩梢枯死。目前在我國，平頭炭疽菌可危害番茄、火龍果、南瓜等，但平頭炭疽菌侵染葡萄僅在瑞士有過報道，我國尚未見相關的研究報道。

據調查，在北鎮(zhèn)由炭疽病菌引起的葡萄葉斑病在夏季雨季過后發(fā)病嚴重，說明炭疽病的發(fā)生與雨水關系密切，高溫高濕的環(huán)境有利用于病原菌的生長，因此在病害易發(fā)生的季節(jié)應加強果園管理，及時清除病葉，避免通風不良、澆水過多的情況發(fā)生，病害發(fā)生嚴重時，需選擇合適的殺菌劑進行防治。Greer等的研究顯示，膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌在侵染特性和對殺菌劑的敏感性方面表現不同。尖孢炭疽菌侵染速度快于膠孢炭疽菌，并且對克菌丹、三環(huán)唑的敏感性要顯著高于尖孢炭疽菌。而膠孢炭疽菌對苯菌靈的敏感性要高于尖孢炭疽菌。鄧維萍等的報道也證實了這點。因此需對平頭炭疽菌對殺菌劑的敏感性進行測定，以篩選出高效、安全的藥劑投入到葡萄葉斑病的防治中，結合農業(yè)栽培、生物防控等多種措施，構建完善的綜合防控技術體系，防控病害的進一步發(fā)生和蔓延。