不同培養(yǎng)基對(duì)玫煙色棒束孢菌株的復(fù)壯研究

郭恒 趙義濤 鄭海霞 張仙紅

關(guān)鍵詞玫煙色棒束孢;復(fù)壯;毒力;產(chǎn)孢量

蟲(chóng)生真菌是一類重要的昆蟲(chóng)病原微生物，但經(jīng)多次繼代培養(yǎng)后，常常會(huì)發(fā)生菌落顏色、生長(zhǎng)形式等的變化，特別是產(chǎn)孢能力下降甚至喪失，進(jìn)而導(dǎo)致蟲(chóng)生真菌的毒力大幅度降低，這種表型退化、表型不穩(wěn)定、表型惡化、雙重表型、突變和衰變均可稱為菌株退化。蟲(chóng)生真菌退化的原因多種多樣，據(jù)樊美珍報(bào)道，菌株本身遺傳物質(zhì)改變及培養(yǎng)基成分和環(huán)境條件的影響可導(dǎo)致菌株退化;李琳等通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，綠僵菌中一些參與脅迫響應(yīng)和衰老的相關(guān)基因在退化菌株中顯著上調(diào)，推測(cè)退化菌株表現(xiàn)為老化現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)活性氧（ROS）引起的線粒體損傷是導(dǎo)致菌株退化的機(jī)制之一;此外，轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入，真菌雙鏈RNA病毒的入侵或者染色體的缺失等均可導(dǎo)致菌種退化。但這些原因都不能很好地解釋真菌退化的頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)這些事件發(fā)生的概率，且不同菌株退化頻率也不盡相同，因此人們嘗試通過(guò)多種方法恢復(fù)菌種原有性狀。

蟲(chóng)生真菌頻繁發(fā)生的菌種退化，成為其大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用所面臨的重要問(wèn)題，也為菌種保藏工作帶來(lái)很大的困難。研究表明，蟲(chóng)生真菌可采用蟲(chóng)尸接種、宿主感染、培養(yǎng)基分離、培養(yǎng)基添加外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等方法復(fù)壯。如鄒東霞等采用馬尾松毛蟲(chóng)Dendrolimus punctatus Walker蟲(chóng)尸對(duì)球孢白僵菌Beauveria bassiana（Bals.-Criv.）Vuill.BD-10-4菌株進(jìn)行了復(fù)壯;馬元偉等通過(guò)培養(yǎng)基中添加外源氨基酸對(duì)羅伯茨綠僵菌Metarhizium robertsii J.F.Bisch.S.A.Rehner&Humber ARSEF2575菌株進(jìn)行了復(fù)壯，并有效延緩了蛹蟲(chóng)草Cordycepsmilitaris Link 01菌株的退化;Bult等研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)大蠟螟Galleria mellonella Linnaeus和黃粉蟲(chóng)Tenebrio molitor Linnaeus 2種易感菌寄主回接的金龜子綠僵菌M.anisopliae（Metschn.）Sorokin菌株毒力比人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)的顯著增強(qiáng);李亞潔等[6]采取組織分離、孢子分離對(duì)蛹蟲(chóng)草進(jìn)行了復(fù)壯等。

玫煙色棒束孢Wize屬蟲(chóng)草菌科棒束孢屬，可寄生8目40多種昆蟲(chóng)，尤其對(duì)蚜蟲(chóng)、粉虱等刺吸式口器害蟲(chóng)有很強(qiáng)的致病力，所以在害蟲(chóng)生物防治中有著非常重要的作用。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)玫煙色棒束孢的研究報(bào)道主要集中在生物學(xué)、分類鑒定、致病力測(cè)定、致病機(jī)理、防治應(yīng)用等方面，對(duì)菌株的復(fù)壯或預(yù)防菌株退化方面的研究鮮有報(bào)道。為此，本試驗(yàn)采用培養(yǎng)基添加外源營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的方法對(duì)玫煙色棒束孢退化菌株進(jìn)行復(fù)壯，旨在探尋簡(jiǎn)便而有效的復(fù)壯方法，為玫煙色棒束孢的規(guī)?；a(chǎn)和開(kāi)發(fā)利用提供生產(chǎn)用菌株。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試菌株

玫煙色棒束孢菌株P(guān)F904為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治研究室經(jīng)多次轉(zhuǎn)接后退化的菌株。

1.1.2供試培養(yǎng)基

本試驗(yàn)所用培養(yǎng)基及配方見(jiàn)表1。

1.2方法

1.2.1菌株復(fù)壯

將供試菌株分別接種于上述5種培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7d后轉(zhuǎn)接至相同的新培養(yǎng)基上，共轉(zhuǎn)接10代。每代每種均重復(fù)3次，測(cè)定數(shù)據(jù)取平均值。

1.2.2菌株生長(zhǎng)量測(cè)定

使用電子游標(biāo)卡尺在培養(yǎng)皿上以十字交叉法，對(duì)不同培養(yǎng)基上的菌落直徑進(jìn)行測(cè)量，每代培養(yǎng)至14 d時(shí)記錄數(shù)據(jù)。

1.2.3菌株產(chǎn)孢量測(cè)定

將培養(yǎng)好的菌株，利用直徑為7mm的打孔器在固體平板培養(yǎng)基上菌落的中央至邊緣1/2處打孔取樣，放人有10 mL 0.05%吐溫-80無(wú)菌水中，使用渦旋振蕩儀將孢子充分洗脫混勻，然后用滅菌紗布過(guò)濾。利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)測(cè)量，換算成單位面積的孢子產(chǎn)量。每種培養(yǎng)基各取3個(gè)平板作為重復(fù)。

1.2.4室內(nèi)毒力測(cè)定

將培養(yǎng)好的菌落，用10mL 0.05%吐溫-80無(wú)菌水洗脫適量孢子，分別制成孢子含量為107個(gè)/mL的孢子懸浮液，采用浸蟲(chóng)法進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定。選取生長(zhǎng)一致的小菜蛾3齡幼蟲(chóng)，浸入孢子懸浮液中10s后取出，用濾紙吸去蟲(chóng)體上多余的菌液，然后放入有甘藍(lán)葉片的9cm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每皿20頭，保持皿內(nèi)濕度。各試驗(yàn)處理重復(fù)3次，并用0.05%的吐溫-80溶液作為對(duì)照處理。連續(xù)觀察7d，記錄死亡蟲(chóng)數(shù)，并將死亡的蟲(chóng)體挑出，保濕培養(yǎng)，死亡蟲(chóng)體變僵硬并長(zhǎng)出菌絲視為有效感染死亡，并計(jì)算校正死亡率。

校正死亡率=（處理死亡率一對(duì)照死亡率）/（1-對(duì)照死亡率）×100%。

1.2.5恢復(fù)比例測(cè)定

試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)菌株產(chǎn)孢量以及毒力兩項(xiàng)指標(biāo)的恢復(fù)情況進(jìn)行比較，并取測(cè)定數(shù)據(jù)的平均值分別計(jì)算得出相應(yīng)恢復(fù)比例。試驗(yàn)共復(fù)壯培養(yǎng)10代，每培養(yǎng)5代測(cè)定一次，分別在第5代和第10代測(cè)量2次。

復(fù)壯培養(yǎng)至第5代時(shí)產(chǎn)孢量及毒力恢復(fù)比例：

恢復(fù)比例第5代菌株測(cè)定值一初始菌株測(cè)定值/初始菌株測(cè)定值。

復(fù)壯培養(yǎng)至第10代時(shí)產(chǎn)孢量及毒力恢復(fù)比例：

恢復(fù)比例第10代菌株測(cè)定值一第5代菌株測(cè)定值第5代菌株測(cè)定值。

1.2.6數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均使用IBM SPSS Statistics 20.0軟件和Excel 2010軟件進(jìn)行分析處理。

2結(jié)果與分析

2.1玫煙色棒束孢菌落形態(tài)的變異

隨著傳代次數(shù)的增多，PDA上培養(yǎng)的玫煙色棒束孢菌落濃密的同心圓紋逐漸消失，有的菌落產(chǎn)生扇形條紋，且伴有菌落質(zhì)地變疏松、稀薄，孢子層變薄的現(xiàn)象，菌落顏色逐漸失去原有的淺粉色而變?yōu)榘咨?，菌落形態(tài)也由絨毛狀變?yōu)樾鯛?。但在?fù)壯培養(yǎng)基上這些現(xiàn)象只在前5代偶有發(fā)生，且氣生菌絲生長(zhǎng)較PDA培養(yǎng)基少，說(shuō)明添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的復(fù)壯培養(yǎng)基對(duì)于延緩和預(yù)防菌株退化變異具有一定的作用。

2.2不同培養(yǎng)基對(duì)玫煙色棒束孢菌落生長(zhǎng)的效果

通過(guò)對(duì)培養(yǎng)14d后的玫煙色棒束孢菌落直徑的對(duì)比發(fā)現(xiàn)，甲殼素培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)速率較快且穩(wěn)定，從第4代開(kāi)始與對(duì)照PDA培養(yǎng)基具有顯著性差異，從第6代開(kāi)始與其前4代具有顯著性差異，培養(yǎng)至10代時(shí)菌落直徑最大，達(dá)69.33mm，各代平均為65.39mm。其次是蠶蛹培養(yǎng)基，從第4代開(kāi)始與其第2代具有顯著性差異，但之后6代生長(zhǎng)速率變慢，各代平均為63.18mm。綜合培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速率也較為穩(wěn)定，但復(fù)壯過(guò)程中，每2代之問(wèn)直徑變化幅度較小，14d時(shí)菌落直徑為59.22～64.45mm，平均為61.55mm，波動(dòng)較小。蟬蛻培養(yǎng)基上菌落的生長(zhǎng)速率代際間不穩(wěn)定，在復(fù)壯過(guò)程中生長(zhǎng)時(shí)快時(shí)慢，直徑范圍在60.38～66.51mm之間（表2）?？傮w上每種培養(yǎng)基上的菌落直徑均隨傳代次數(shù)的增加而逐漸增加，菌絲生長(zhǎng)量也增大，其中甲殼素培養(yǎng)基對(duì)菌落生長(zhǎng)具有明顯的促進(jìn)作用，具體原因還需進(jìn)一步研究。

2.3玫煙色棒束孢在不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量

4種不同培養(yǎng)基復(fù)壯后玫煙色棒束孢的產(chǎn)孢量如圖1所示。從第2代開(kāi)始經(jīng)4種培養(yǎng)基復(fù)壯后的菌株，產(chǎn)孢量與初始菌株具有顯著性差異。經(jīng)蠶蛹培養(yǎng)基復(fù)壯的菌株，產(chǎn)孢量恢復(fù)效果最好，在復(fù)壯培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)孢量一直處于最高水平，從第8代開(kāi)始與其他3種培養(yǎng)基產(chǎn)孢量均具有顯著性差異，連續(xù)復(fù)壯10代后，菌株產(chǎn)孢量可達(dá)1.73×10個(gè)/cm2，提升3倍之多。綜合培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量?jī)H次于蠶蛹培養(yǎng)基，始終與甲殼素培養(yǎng)基和蟬蛻培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量具有顯著性差異，連續(xù)復(fù)壯培養(yǎng)10代后，綜合培養(yǎng)基產(chǎn)孢量為1.58×10個(gè)/cm2。甲殼素培養(yǎng)基復(fù)壯的效果次之，單位面積產(chǎn)孢量為1.33×10個(gè)/cm2。效果較差的是蟬蛻培養(yǎng)基，復(fù)壯10代后與其他3種培養(yǎng)基均具有顯著性差異，產(chǎn)孢量?jī)H為初始菌株的2.6倍。

2.4玫煙色棒束孢在不同培養(yǎng)基上的毒力

復(fù)壯后的玫煙色棒束孢菌株對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的致死中時(shí)（LT50）和校正死亡率如表3所示。小菜蛾幼蟲(chóng)接種不同培養(yǎng)基復(fù)壯的菌株后，第3天幼蟲(chóng)出現(xiàn)死亡，對(duì)照也有個(gè)別幼蟲(chóng)死亡，第4天開(kāi)始有僵蟲(chóng)出現(xiàn)，死亡率隨著接種時(shí)問(wèn)逐日遞增，各菌株侵染7d后，大部分幼蟲(chóng)死亡，個(gè)別結(jié)繭化蛹。

如表3所示，4種復(fù)壯培養(yǎng)基均表現(xiàn)出明顯的復(fù)壯效果，致死中時(shí)（LT50）均顯著小于初始菌株，其中，甲殼素培養(yǎng)基復(fù)壯的菌株毒力恢復(fù)效果最好，連續(xù)復(fù)壯10代后，菌株對(duì)小菜蛾的致死中時(shí)由初始菌株的5.86 d下降為3.32d，與其他3種培養(yǎng)基均具有顯著性差異，校正死亡率也具有顯著性差異，在第7天的累積校正死亡率達(dá)82%以上;其次是綜合培養(yǎng)基復(fù)壯，LT50第10代下降為3.53 d，在處理后第7天累積校正死亡率也達(dá)76%以上;蟬蛻培養(yǎng)基毒力恢復(fù)效果次之;效果最差的是蠶蛹培養(yǎng)基，復(fù)壯菌株對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的LT50和校正死亡率與其他3種培養(yǎng)基復(fù)壯的菌株相比均具有顯著性差異，且復(fù)壯10代后，第7天的累積校正死亡率僅為68.26%。

2.5玫煙色棒束孢在不同培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量及毒力恢復(fù)比例

比較菌株經(jīng)4種培養(yǎng)基復(fù)壯10代后，菌株產(chǎn)孢量和毒力（致死中時(shí)LT50）的恢復(fù)比例如表4所示。玫煙色棒束孢菌株在經(jīng)過(guò)不同培養(yǎng)基復(fù)壯后，菌株的產(chǎn)孢量和毒力均有大幅提高，總體趨勢(shì)呈現(xiàn)復(fù)壯1～5代恢復(fù)比例較高，5～10代恢復(fù)比例有所下降。經(jīng)10代復(fù)壯，甲殼素培養(yǎng)基恢復(fù)比例較為穩(wěn)定，下降速率比其他3種培養(yǎng)基低，恢復(fù)效果較穩(wěn)定。而蠶蛹培養(yǎng)基兩項(xiàng)指標(biāo)的恢復(fù)比例均在培養(yǎng)過(guò)程中下降幅度較大。

在產(chǎn)孢量方面，初始菌株經(jīng)過(guò)蠶蛹培養(yǎng)基5代復(fù)壯后，恢復(fù)比例可達(dá)126.8%，之后5代的恢復(fù)比例下降為87.4%，但與其他復(fù)壯培養(yǎng)基恢復(fù)比例相比均為最高值。在毒力方面，初始菌株經(jīng)過(guò)甲殼素培養(yǎng)基5代復(fù)壯后，恢復(fù)比例為25.77%，之后5代復(fù)壯恢復(fù)比例僅下降為23.68%，與其他復(fù)壯培養(yǎng)基恢復(fù)比例相比也均為最高值。

3結(jié)論與討論

3.1產(chǎn)孢量

蟲(chóng)生真菌菌株的產(chǎn)孢量是衡量菌株活力的重要指標(biāo)之一。菌株具有較高的產(chǎn)孢量和高質(zhì)量的孢子是其可以應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的必備條件。據(jù)報(bào)道，培養(yǎng)基是影響微生物生長(zhǎng)和繁殖的重要因素之一，即營(yíng)養(yǎng)對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)孢有很大影響，若不能滿足菌落生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)條件，許多菌株就不能生長(zhǎng)或產(chǎn)孢。浦靜等研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中以麥芽糖為碳源可能更利于玫煙色棒束孢菌株產(chǎn)孢;此外培養(yǎng)基中添加適量的動(dòng)物性氮源也有助于菌株產(chǎn)孢。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加含氮量較高的動(dòng)物性氮源蠶蛹粉的培養(yǎng)基使供試菌株的產(chǎn)孢量恢復(fù)最好，其次是綜合培養(yǎng)基和甲殼素培養(yǎng)基復(fù)壯，蟬蛻培養(yǎng)基復(fù)壯效果最差。這可能和培養(yǎng)基中動(dòng)物性氮源含量有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步探索。

3.2毒力

蟲(chóng)生真菌菌株的毒力是衡量菌株應(yīng)用潛力的重要指標(biāo)。蔡國(guó)貴等研究發(fā)現(xiàn)，菌株在營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)相對(duì)穩(wěn)定，在營(yíng)養(yǎng)貧瘠的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)則容易變異，不同培養(yǎng)基通過(guò)影響菌株酶的表達(dá)水平引起菌株毒力的變化;李會(huì)平等研究發(fā)現(xiàn)，白僵菌菌株產(chǎn)酶能力與其對(duì)桑天牛幼蟲(chóng)的毒力呈正相關(guān)關(guān)系，培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件會(huì)影響菌株的產(chǎn)酶能力，進(jìn)而影響菌株毒力。甲殼素粉中蘊(yùn)含的磷脂與蛋黃素可促進(jìn)分生孢子的萌發(fā)和有效侵染，且穩(wěn)定甚至增強(qiáng)菌株毒性。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試菌株經(jīng)甲殼素培養(yǎng)基復(fù)壯后對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)毒力恢復(fù)效果最好，這可能是因?yàn)槊禑熒羰呔暝谖掌錉I(yíng)養(yǎng)后，能較好地誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，并增強(qiáng)了該酶的活性有關(guān)。

3.3恢復(fù)比例

分析試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在多次復(fù)壯的過(guò)程中，4種培養(yǎng)基均表現(xiàn)出了隨著復(fù)壯代數(shù)的增加產(chǎn)孢量和毒力的恢復(fù)效果逐漸減弱的現(xiàn)象，但是甲殼素培養(yǎng)基具有相對(duì)較好的穩(wěn)定性，恢復(fù)效果的下降速率較慢，原因可能是幾丁質(zhì)是真菌細(xì)胞壁的主要組成成分，對(duì)菌株的生長(zhǎng)發(fā)育必不可少，同時(shí)也提高了菌株體內(nèi)幾丁質(zhì)酶的活力。其次是綜合培養(yǎng)基恢復(fù)效果較好，可能是綜合培養(yǎng)基具有更多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，形成了穩(wěn)定的組合，能讓菌株吸收不同性狀生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)。而蟬蛻培養(yǎng)基在復(fù)壯過(guò)程中對(duì)菌株2個(gè)指標(biāo)的提升比例均不突出。此外添加蠶蛹粉的培養(yǎng)基僅使菌株在產(chǎn)孢量方面有大幅度提高，在毒力方面復(fù)壯效果不突出，且恢復(fù)比例波動(dòng)較大，可見(jiàn)其穩(wěn)定性不足，具體原因還有待進(jìn)一步探索。

綜上所述，動(dòng)物性氮源對(duì)玫煙色棒束孢的產(chǎn)孢有促進(jìn)作用，所以經(jīng)蠶蛹培養(yǎng)基復(fù)壯獲得的菌株產(chǎn)孢量有了明顯的提高，但對(duì)小菜蛾幼蟲(chóng)的毒力并沒(méi)有顯著的恢復(fù)，說(shuō)明產(chǎn)孢量大的菌株毒力不一定強(qiáng)。甲殼素培養(yǎng)基對(duì)玫煙色棒束孢菌株的生長(zhǎng)和毒力均有明顯的促進(jìn)作用，但在產(chǎn)孢量方面恢復(fù)效果一般，其恢復(fù)比例較穩(wěn)定。因此，在生產(chǎn)中應(yīng)用玫煙色棒束孢菌株，應(yīng)根據(jù)具體需要綜合考慮多種指標(biāo)的影響選擇復(fù)壯添加的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。