木霉不同施用方式對黃瓜膜脂過氧化作用、保護性酶活性及枯萎病防效的影響

宿暢 廉華 馬光恕 李梅 高玉剛

關(guān)鍵詞木霉;黃瓜;枯萎病;保護性酶;丙二醛;質(zhì)膜透性

黃瓜是我國主要的蔬菜種類之一。近年來，黃瓜土傳病害特別是黃瓜枯萎病在全國各種植區(qū)幾乎都有發(fā)生，嚴重威脅黃瓜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。該病的病原為尖孢鐮刀菌黃瓜專化型Fusarium oxys-porum f.sp.cuculnerinuln Owen（Foc）。長期以來，黃瓜枯萎病的防治以化學(xué)農(nóng)藥為主，隨著環(huán)境安全、食品安全問題的日益嚴峻，運用生物手段預(yù)防和控制植物病害的發(fā)生、發(fā)展受到廣泛關(guān)注。

木霉Trichoderma spp.能夠拮抗多種植物病原真菌。利用木霉防治黃瓜土傳病害已有較多的研究報道。如哈茨木霉T harzianum T2-16對西瓜枯萎病的田問防效達到53.11;棘孢木霉T.as-perellum 437對黃瓜立枯病的防治效果達到76.6%，病情指數(shù)從對照的41.5下降到9.7;畢卉比較了不同木霉對黃瓜枯萎病的防治效果，其中長枝木霉T.longibrachiatum TL對黃瓜枯萎病的防效最高，達到75.74%，其次為綠色木霉T.viride TV，防效達到70.76%。此外，木霉還對植物表現(xiàn)出良好的促生作用。

植物對病害都具有一定程度的抵抗能力，稱為廣義的抗病性。誘導(dǎo)植物抗病性是木霉防治植物病害的主要機制之一。在正常情況下，植物細胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生和消除處于平衡狀態(tài)，當(dāng)植物處于病原菌侵染或其他逆境脅迫時，細胞內(nèi)的自由基平衡就會遭到破壞出現(xiàn)自由基積累，產(chǎn)生丙二醛（malonicdialdehyde，MDA）等產(chǎn)物，從而對植物細胞產(chǎn)生氧化脅迫并導(dǎo)致膜系統(tǒng)損傷，胞內(nèi)電解質(zhì)外滲導(dǎo)致細胞的相對電導(dǎo)率增大，因此，MDA含量和相對電導(dǎo)率的高低直接反映了細胞脂質(zhì)過氧化的程度，常用作判斷植物脅迫損傷程度的指標，在植物的抗病應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。植物的保護性酶系主要包括過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）、多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）、過氧化物酶（peroxi-dase，POD）等，這些酶的活性往往與植物抗病性呈正相關(guān)。李欣欣等利用堆肥提取液處理草莓，使草莓POD和PPO活性分別提高了45.45%和39.47%，MDA含量降低了14.83%，對草莓黃萎病的防治效果達到42.23%。張曉夢等利用綠色木霉M1和棘孢木霉M2發(fā)酵液的50～100倍稀釋液噴施辣椒，顯著提高了辣椒葉片中POD、PPO和PAL的活性。目前，利用木霉防治黃瓜土傳病害已有較多的研究報道，但木霉施用方式對黃瓜的生長、防御體系以及對病害防效的影響缺乏系統(tǒng)研究。課題組前期篩選了3株對黃瓜枯萎病菌有較強拮抗作用的木霉，分別為棘孢木霉T.asperellum 525、哈茨木霉T.harzianum 610和擬康氏木霉T.pseud-okoningii 886，采用不同施用方式處理黃瓜幼苗，測定其對黃瓜幼苗生長、膜脂過氧化作用、保護性酶活性變化及枯萎病的防治效果，為提高木霉菌劑的防病效果、保障黃瓜安全生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1供試材料

1.1.1供試黃瓜品種

‘長春密刺購自山東泰安市裕園種業(yè)有限公司。

1.1.2供試培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂10g，蒸餾水1000mL，pH7.0～7.2。馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PD）：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水1000mL，pH7.0～7.2。

1.1.3供試菌株

棘孢木霉T.asperellum 525（T525）、哈茨木霉T.harzianum 610（T610）、擬康氏木霉T.pseud-okoningii 886（T886），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所木霉菌研究組提供。黃瓜枯萎病病原菌Fu-sarium oxysporum f.sp.cucumebrium Owen（Foc），由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所土傳病害生物防治研究組提供。

1.1.4供試土壤

草炭土，過1mm篩后160℃高溫滅菌2h，自然冷卻后再在160℃下滅菌2h，放涼備用。

1.2菌液的制備

1.2.1木霉孢子懸浮液的制備

在PDA平板上活化木霉T525、T610、T886菌株，28℃培養(yǎng)3d，取菌落邊緣5mm菌餅，轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7d，待菌絲和孢子長滿平板，用無菌水洗下孢子，孢子濃度調(diào)整為1.5×10個/mL備用。

1.2.2病原菌孢子懸浮液的制備

在PDA平板上活化培養(yǎng)病原菌Foc，28℃培養(yǎng)3d，菌落邊緣取5mm的菌餅5塊，接種到100mLPD培養(yǎng)基中，28℃、120r/min振蕩培養(yǎng)7d，4層紗布過濾，濾液5000 r/min離心，收集孢子，用無菌水調(diào)整孢子濃度為1×10個/mL。

1.3盆栽試驗方法

1.3.1試驗設(shè)計

試驗地點位于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院教學(xué)基地日光溫室。育苗盤（34.5cm×24cm×11cm）裝入滅菌土，黃瓜種子催芽后，每盤播人80粒種子。出苗后，根據(jù)苗勢保留大小一致的小苗50株。播種后澆無菌水，每次每盤1000mL左右，保證黃瓜正常出苗和生長。

在黃瓜第一片真葉展開時（播種后5d），進行真菌孢子懸液灌根處理，每個育苗盤用量為150mL，即保證黃瓜單株接種量為3mL。試驗共設(shè)5個處理：1）木霉和病原菌孢子懸浮液同時接種（TF）;2）木霉先接種，2 d后接種病原菌（T-F）;3）病原菌先接種，2 d后接種木霉（F-T）;4）只接種病原菌（F）;5）只接種無菌水（CK）。隨機區(qū)組設(shè)計，每個處理3盤，5次重復(fù)。播種后8～14d取黃瓜葉片，每個處理選取15株，其中5株用于測定黃瓜幼苗生長指標，10株用于測定膜脂過氧化和保護性酶活性。

1.3.2試驗測定指標與方法

1）生長指標測定：株高，用直尺測定黃瓜苗莖基部到生長點的距離;莖粗，用游標卡尺測定子葉節(jié)下1cm處直徑。地上部、地下部鮮重用千分之一電子天平測定，植株樣品用清水反復(fù)沖洗并用吸水紙吸干。

2）膜脂過氧化指標測定：葉片質(zhì)膜透性采用電導(dǎo)率法，使用DDS-11A型電導(dǎo)率儀;丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法;超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）、多酚氧化酶（PPO）活性分別采用氮藍四唑法、愈創(chuàng)木酚比色法、高錳酸鉀滴定法和滴定法測定。

3）黃瓜苗期枯萎病標準：0級，無癥狀;1級，真葉、子葉黃化或萎蔫面積不超過總面積的50%;2級，真葉、子葉黃化或萎蔫面積超過總面積的50%;3級，葉片萎蔫或枯死，僅生長點存活;4級，全株嚴重萎蔫，以致枯死。

病情指數(shù)=[∑（病級株數(shù)×代表級值）/（植株總數(shù)×最高代表級值）]×100;

防治效果=（對照病情指數(shù)一處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

顯著性分析采用DPS 7.05軟件完成，圖表制作采用Microsoft Excel 2007完成。

2結(jié)果與分析

2.1木霉不同施用方式對黃瓜幼苗生長的影響

2.1.1木霉不同施用方式對黃瓜幼苗株高和莖粗的影響

黃瓜播種后14d，分別測定木霉不同施用方式處理的黃瓜幼苗株高和莖粗，結(jié)果如圖1。只接種病原菌（F）的黃瓜幼苗株高和莖粗最低，分別為6.66cm和2.11mm，顯著低于其他處理，木霉處理的黃瓜幼苗株高和莖粗均顯著高于F和只接種無菌水的對照CK，表明枯萎病菌對黃瓜幼苗株高和莖粗有明顯的抑制作用，施用木霉則能夠促進黃瓜幼苗生長。此外，3株木霉的不同施用方式對黃瓜幼苗生長的促進作用存在差異。其中以先接種木霉，2d后接種病原菌的T-F處理的促進作用較大，表明先接種木霉有利于植株的生長，并以擬康氏木霉T886的T886-F處理的黃瓜幼苗株高和莖粗最高，分別為8.23cm和2.62mm。

2.1.2木霉不同施用方式對黃瓜幼苗地上部和地下部鮮重的影響

播種后14d，測定木霉不同施用方式處理的黃瓜幼苗地上部和地下部鮮重，結(jié)果如圖2。F處理的黃瓜幼苗地上部鮮重和地下部鮮重最低，顯著低于CK，分別為1.13g和0.17g，表明枯萎病菌顯著降低了黃瓜幼苗的鮮重。木霉處理的黃瓜幼苗地上部鮮重和地下部鮮重均顯著高于F和CK，表明木霉能夠促進黃瓜幼苗的物質(zhì)積累。3種不同施用方式中，T-F處理對黃瓜幼苗鮮重的促進作用均高于TF和F-T處理，并以T886菌株的T886-F處理的幼苗地上部和地下部鮮重最高，分別為1.59g和0.48g，表明這3株木霉中，以提前施用T886菌株對黃瓜幼苗的物質(zhì)積累的促進作用最強。

2.2木霉不同施用方式對黃瓜膜脂過氧化作用和保護性酶的影響

2.2.1木霉不同施用方式對黃瓜幼苗葉片質(zhì)膜透性的影響

播種后8、10、12、14 d，分別測定木霉不同處理的黃瓜幼苗葉片的葉片質(zhì)膜透性，結(jié)果如圖3。病原菌處理F和CK的葉片相對電導(dǎo)率均表現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，并且F顯著高于同期的CK，表明枯萎病菌增加了黃瓜幼苗葉片質(zhì)膜透性，對細胞膜具有破壞作用。

木霉3種施用方式處理的黃瓜葉片相對電導(dǎo)率均低于F，并且呈現(xiàn)出先升高后降低的變化規(guī)律，峰值出現(xiàn)在播種后12d，表明施用木霉能夠緩解枯萎病菌對黃瓜細胞膜的破壞作用，降低質(zhì)膜透性，其中以先接種木霉后接種病原菌處理（T-F）的下降幅度最大，且以T886-F處理的葉片質(zhì)膜透性最低。在播種后14 d，T525-F、T610-F、T886-F處理的黃瓜幼苗葉片相對電導(dǎo)率分別為37.67%、39.78%和36.95%，分別比F下降了35.79%、32.20%和37.02%。

2.2.2木霉不同施用方式對黃瓜幼苗葉片丙二醛含量的影響

播種后8、10、12、14 d，分別測定不同處理的黃瓜幼苗葉片中的MDA含量，結(jié)果如圖4。F處理葉片的MDA含量顯著高于CK，并逐漸升高，表明枯萎病菌能夠造成黃瓜葉片細胞膜的膜脂過氧化作用，提高了葉片MDA含量。木霉不同施用方式處理的黃瓜葉片MDA含量均低于F，呈現(xiàn)出先升高后下降的變化規(guī)律，且峰值均出現(xiàn)在播種后12 d，與葉片質(zhì)膜透性變化規(guī)律一致。表明施用木霉能夠緩解枯萎病菌對黃瓜幼苗葉片細胞膜的破壞作用。

3株木霉的3種施用方式中，以T-F處理的降幅最大，且以T886的T886-F處理葉片的MDA含量最低。在播種后14 d，3株木霉處理的黃瓜幼苗MDA含量均表現(xiàn)為F>F-T>TF>T-F>CK，T610-F、T525-F和T886-F處理的黃瓜幼苗葉片MDA含量分別為2.38、2.49和2.36"m01/g，分別比F下降了14.08%、10.11%和14.80%。

2.2.3木霉不同施用方式對黃瓜幼苗葉片保護性酶活性的影響

播種后8、10、12、14 d，測定木霉不同處理黃瓜幼苗葉片中的保護性酶活性（圖5～8）。F處理葉片中SOD、POD、CAT、PPO活性均呈現(xiàn)先升高后下降的變化規(guī)律，最高值出現(xiàn)在播種后12 d。CK葉片中上述酶活性隨播種時問的延長，表現(xiàn)出緩慢上升的趨勢，在播種后14 d，SOD最高值為387.56 U/g（圖5），POD最高值為3.94 u/（g·min）（圖6），CAT最高值為2.15 m/（g·min）（圖7），PPO最高值為3.72 mg/（g·min）（圖8），為播種后8 d的葉片中相應(yīng)酶活性的1.10～1.97倍。經(jīng)木霉處理的黃瓜葉片的上述4種酶活性均高于F和CK，并呈現(xiàn)逐漸升高的變化規(guī)律，表明施用木霉能夠誘導(dǎo)葉片保護性酶活性的提高，提高了黃瓜對枯萎病的抗性。3種施用方式中，以T-F處理的黃瓜葉片中保護l！生酶活性相對最高，并且T886的誘導(dǎo)能力高于T525和T610。播種后14 d，T525-F、T610-F、T886-F處理的黃瓜幼苗葉片SOD活性分別為503.27、496.86 U/g和506.73 U/g，比F分別提高了45.82 9/6、43.96%和46.82%;POD活性分別為4.97、4.82 U/（g·min）和5.06 U/（g·min），比F提高了32.53%、28.53%和34.93%;CAT活性分別為2.54、2.43和2.66 mg/（g·min），比F提高了13.39%、8.48%、18.75%;PPO活性分別為4.19、4.08mg/（g·min）和4.32mg/（g·min），比F提高了8.27%、5.43%和11.63%。

2.3木霉不同施用方式對黃瓜幼苗枯萎病防治效果的影響

黃瓜播種后14 d，3株木霉3種施用方式對黃瓜幼苗枯萎病的防治效果如圖9。F處理黃瓜幼苗病情指數(shù)最高，為49.39，顯著高于其他處理。3種施用方式中，以T-F處理的病情指數(shù)最低，說明提前施用木霉，有助于對枯萎病的防治。3株木霉對枯萎病的防治效果均達到64.78%以上，其中T886對枯萎病的防效高于T525和T610，T886-F處理對黃瓜枯萎病的盆栽防治效果最高，達到81.54%。

3討論

木霉對至少18個屬20余種植物病原菌有拮抗作用。利用生防木霉防治鐮刀菌引起的植物土傳病害已有較多的研究報道。如利用哈茨木霉TH防治黃瓜枯萎病，防治效果達到64.34%，綠色木霉TV菌株對黃瓜枯萎病的防效為47.49%。本研究的3株木霉，均對黃瓜枯萎病具有良好的防治效果，其中擬康氏木霉886的防效好于棘孢木霉525和哈茨木霉610，在應(yīng)用時，先接種T886，對黃瓜枯萎病的盆栽防效最高，達到81.5%，有重要的田間應(yīng)用前景。

木霉不僅能夠防治植物病害，還對植物具有良好的促生作用，如利用綠色木霉TV處理黃瓜，其地上部分和地下部分鮮重分別比對照增加了42.81%和86.92%木霉GYXM-lpl處理甘藍，處理后甘藍植株的總鮮重和總干重分別較清水對照增加了417.60%和762.69%本研究的3株木霉處理的黃瓜幼苗，其地上部鮮重和地下部鮮重都顯著高于接無菌水對照，表現(xiàn)出良好的促生作用，與文獻報道的結(jié)果一致。

當(dāng)植物受病原菌侵染后，木霉等生防微生物能夠誘導(dǎo)植物保護性酶活性提高，增強植物體的抗病防御功能。如利用生防菌TB2處理甘蔗，可提高葉片中PPO、POD、SOD、PAL、CAT等酶的活性，提高了甘蔗對赤腐病的抗性。本研究中，提前施用木霉，有助于提高黃瓜幼苗保護性酶的活性，提高病害的防治效果。同時，SOD、POD和CAT等保護性酶活性下降與MDA積累密切相關(guān)，可能互為因果，即一方面由于SOD、POD和CAT活性下降，使有害自由基積累乃至超過傷害閾值，可能直接或者問接地啟動膜脂過氧化作用，使MDA含量增加，膜系受損;另一方面，MDA的積累反過來抑制SOD、POD和CAT的活性，從而喪失了保護酶系統(tǒng)的功能，進一步促使膜系損傷加重深綠木霉T2具有降低百合MDA含量、誘導(dǎo)百合抗灰霉病的作用;袁揚等人用木霉處理鴨茅Dactylis glomerata L，能有效降低鴨茅中MDA含量，提高植株的抗病性;趙忠娟等報道，哈茨木霉LTR-2能降低鹽堿脅迫下蔬菜幼苗相對電導(dǎo)率和MDA含量，進而提高黃瓜、蘿卜和番茄對鹽脅迫的耐受性。本研究的3株木霉均能誘導(dǎo)黃瓜幼苗葉片質(zhì)膜透性和MDA含量顯著下降，提高黃瓜對枯萎病的抗病能力，具有與其他生防菌相似的防病機制。

生防菌的施用方式對病害的防治效果有顯著的影響，如李紀順等采用木霉融合子與瓜果腐霉處理番茄，結(jié)果顯示，二者結(jié)合處理或木霉融合子單獨處理均可以顯著提高番茄葉片中SOD、POD及CAT的活性，并以結(jié)合處理的酶活性最大。長枝木霉T115D發(fā)酵液可誘導(dǎo)大豆葉片PAL、POD、PPO、SOD和CAT的活性增強，用發(fā)酵液和疫霉同時灌根處理對大豆疫病的防效最好，達到51.8%本研究中木霉的3種施用方式中，以先接種木霉后接種病原菌的處理對黃瓜幼苗保護性酶的誘導(dǎo)作用最強，病害的防治效果最好，與莫賤友等、余小蘭等等的報道結(jié)果類似。推測先接種木霉可使之優(yōu)先在植物根際定殖，占領(lǐng)營養(yǎng)和空間，提高了對病原菌的拮抗能力，同時木霉提前誘導(dǎo)植物抗性酶使其活性增強，提高了植物的抗病性。因此，在實際應(yīng)用中，提前施人木霉有利于提高黃瓜幼苗質(zhì)量，提高防病能力和病害防治效果。本研究為開發(fā)高效生防木霉菌劑、指導(dǎo)產(chǎn)品應(yīng)用、提高防病效果提供了依據(jù)。