滇樸叢芽病植原體的分子鑒定

陳健鑫 張宏雁 魏玉倩 洪英娣 馬煥成 伍建榕

關(guān)鍵詞滇樸叢芽病;植原體;掃描電鏡（SEM）;PCR;系統(tǒng)發(fā)育樹

滇樸，又名昆明樸、西藏樸、石樸，為榆科ulmaceae樸屬celtis的一種高大喬木。該樹種分布較廣，在中國(guó)主要分布于云南、西藏、四川和廣西一帶。滇樸有一定的藥用、觀賞、經(jīng)濟(jì)、生態(tài)價(jià)值和一定的滯塵、釋氧能力，在云南昆明作為常見的綠化行道樹被大量人工栽植。滇樸上常發(fā)生由擔(dān)子菌引起的半邊瘋病、干基腐朽病和由子囊菌引起的白粉病。由植原體引起的叢芽病尚未見報(bào)道。

植原體（phytoplasma）是一類無(wú)細(xì)胞壁，專性寄生于植物韌皮部組織中，難以人工培養(yǎng)的原核生物。植原體主要由刺吸式口器的昆蟲傳播或由植物體無(wú)性繁殖材料傳播，常引起植物矮化、黃化、叢枝和花變?nèi)~等癥狀，給農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)造成較大的損失。由于難以在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，過(guò)去對(duì)于植原體的分類和命名與病毒類似，依據(jù)寄主植物名稱和引起的典型癥狀命名，無(wú)法明確植原體的分類地位。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的普及，利用核糖體DNA序列對(duì)植原體進(jìn)行鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析是常用且簡(jiǎn)便的方法。

本研究首次報(bào)道滇樸枝條發(fā)生叢芽癥狀，并對(duì)表現(xiàn)叢芽癥狀的組織進(jìn)行掃描電鏡觀察及分子檢測(cè)，證實(shí)滇樸叢芽病由植原體引起，并確定其分類地位。

1材料與方法

1.1材料

供試植物：滇樸Celtis kunmingensis健康植株枝條及叢芽病植株枝條采自澄江和昆明，所采樣品均保存于西南林業(yè)大學(xué)森林災(zāi)害預(yù)警控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-80℃超低溫冰箱內(nèi)。

主要試劑：2×CTAB、2%巰基乙醇、氯仿：異戊醇（24：1）、異丙醇、70%乙醇、1×TE、無(wú)菌雙蒸水、植原體16S rDNA通用引物、2×PowerTaq PCRMasterMix、核酸染料（Gelview）、DNA ladder2000、瓊脂糖、1×TAE，均購(gòu)自昆明碩陽(yáng)科技有限公司。

試驗(yàn)對(duì)照：以本實(shí)驗(yàn)室保存的干熱河谷車桑子叢枝病植株總DNA為本試驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照，滇樸健康植株總DNA及無(wú)菌雙蒸水為陰性對(duì)照。

1.2韌皮部組織掃描電鏡觀察

將表現(xiàn)叢芽癥幼嫩枝條組織和健康組織分別切為1mm厚的平整組織塊，用導(dǎo)電膠帶粘貼在載物臺(tái)上噴金處理1min，置于日立S-3000N掃描電鏡下觀察。

1.3滇樸枝條總DNA提取

采用略改動(dòng)的CTAB法提取植物總DNA。方法如下：用無(wú)菌刀片分別切取表現(xiàn)叢芽癥狀的幼嫩枝條及健康的幼嫩枝條，經(jīng)液氮速凍后研磨至粉末狀，用天平分別稱取0.1g迅速轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管內(nèi);加入600μL 65℃預(yù)熱的2×CTAB抽提液及2%巰基乙醇，渦旋混勻1min后置于65℃恒溫水浴鍋內(nèi)溫浴1h，期問(wèn)每隔10min顛倒搖勻1次;取出后冷卻至室溫，加入600μL氯仿：異戊醇（24：1），顛倒混勻2～3min，10000r/min離心15min棄下層廢液后重復(fù)該步驟1次;將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中并加入2/3體積預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻后置于-20℃冰箱30min，10000r/min離心15min后丟棄液體;加入800μL 70%乙醇洗滌DNA沉淀2次，置于超凈工作臺(tái)徹底風(fēng)干;加入50μL 1×TE緩沖液溶解DNA沉淀，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4植原體16S rDNA基因PCR擴(kuò)增

依據(jù)Schneider等和Lee等設(shè)計(jì)的植原體16S rDNA通用引物P1/P7、R16F2/R16R2（表1），采用巢式PCR擴(kuò)增植原體16S rDNA基因。操作如下：將植物總DNA作為模板用于第一輪PCR，反應(yīng)采用30μL體系，含有2XPower Taq 15μL，上下游引物各0.75μL，模板DNA 1μL，ddH20 12.5μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s，48℃退火40s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋20倍作為第二輪PCR的模板，反應(yīng)體系同第一輪PCR，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min;95℃變性30 s，60℃退火1min，72℃延伸90s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。取4μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5巢式PCR產(chǎn)物序列測(cè)定及分析

通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，將明亮單一條帶的巢式PCR產(chǎn)物送昆明碩擎生物科技有限公司測(cè)序。雙向測(cè)通后的序列用DNAMAN 8拼接。依據(jù)Lee等修訂的植原體分類體系，將滇樸叢芽病植原體序列與16SrⅠ～Ⅸ9個(gè)組中的代表序列（表2），進(jìn)行同源性分析并與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性最高的序列進(jìn)行雙序列堿基比較。

1.6系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將拼接結(jié)果提交至National Center for Bio-technology Information（NCBI）核酸數(shù)據(jù)庫(kù)獲得登錄號(hào)并進(jìn)行BLAST比對(duì)。選取植原體16Sr組及亞組的代表菌株，并以Acholeplasma laidlawii為外群（表3），利用Clustalx 1.83進(jìn)行多重對(duì)比，通過(guò)MEGA 6中鄰接法（neighbo-joining，NJ）以1000進(jìn)行bootstrap校驗(yàn)，構(gòu)建基于16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的親緣關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1染病滇樸癥狀表現(xiàn)

染病滇樸的癥狀見圖1。滇樸幼樹易染病，發(fā)病嚴(yán)重的植株主干及側(cè)枝上遍布幾十個(gè)成團(tuán)簇生的不定芽，簇生的不定芽往往不能順利萌發(fā)，易受凍害或日灼影響而枯死。簇生的不定芽在枝條上呈腫瘤狀，極少數(shù)萌發(fā)后長(zhǎng)出小葉，生長(zhǎng)勢(shì)弱的小葉易受病原真菌侵染后變黑枯萎。染病植株較健康植株葉發(fā)黃變小，生長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)量受到抑制。在滇樸幼嫩的枝條和葉片上可見大量木虱，集中在葉片的背面刺吸，葉面出現(xiàn)點(diǎn)狀的褪綠斑且留下了大量的蜜狀分泌物。

2.2韌皮部切片掃描電鏡觀察

染病組織掃描電鏡結(jié)果見圖2。滇樸叢芽部位平整橫切放大1800倍后在韌皮部的篩管組織中可觀察到植原體，菌體較小，橢圓形;健康植株韌皮部組織內(nèi)無(wú)植原體存在。

2.3PCR擴(kuò)增結(jié)果

以滇樸叢芽病植株總DNA為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖3。第一輪PCR擴(kuò)增獲得了約1.8kb的條帶，第二輪PCR獲得約1.2kb的條帶，該片段大小與陽(yáng)性對(duì)照片段和預(yù)期片段大小基本一致，以健康組織總DNA及ddH20為模板的陰性對(duì)照未擴(kuò)增出特異性條帶。結(jié)果表明：表現(xiàn)叢芽癥狀的滇樸存在植原體，暫將其定名為滇樸叢芽植原體（Celtis kunmingensis plexus bud phytoplasma，CKPD）。

2.4滇樸叢芽病植原體16SrDNA序列分析

通過(guò)同源性分析，結(jié)果表明2個(gè)地區(qū)的顯癥滇樸巢式PCR產(chǎn)物序列相似性為100%，因此選擇昆明地區(qū)滇樸叢芽病植原體的擴(kuò)增序列進(jìn)行后續(xù)分析。巢式PCR擴(kuò)增獲得1條1179bp的植原體16SrDNA序列（GenBank登錄號(hào)：MTl60417），其中G+C占比47.24%，該百分比處于植原體16S rDNA序列G+C比例的范圍內(nèi)（47%～48%）。將滇樸叢芽病植原體16SrDNA序列與16Sr組中已知分類地位的9個(gè)代表菌株的序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明滇樸叢芽病植原體與Aster yellows phytoplas-ma，AY相似性最高，達(dá)到99.20%，初步判定其屬于16Sr工組中的成員;通過(guò)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性最高的芝麻變?nèi)~植原體Sesame phyllody phyto-plasma，SeP（KF728953）進(jìn)行雙序列堿基比對(duì)，發(fā)現(xiàn)二者相似性高達(dá)99.40%，兩者16S rDNA堿基序列存在11個(gè)位點(diǎn)的差異，分別位于滇樸叢芽病植原體堿基序列的第2、3、17、18、216、849、865、869、870、874、1163位。

2.5系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

通過(guò)MEGA 6中鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），結(jié)果表明CKPD與Maize bushy stunt phyto-plasma，MaBS（AY265208）、Aster yellows phyto-plasma，AY（L33767）及SeP（KF728953）處于同一進(jìn)化支，共同聚為16SrⅠ組，且系統(tǒng)發(fā)育樹中所有植原體株系均與外群菌株A.laidlawii有較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，再選取16SrⅠ組中各亞組的代表菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5），結(jié)果表明CKPD與Dogfennelyellows phytoplasma，DfY和SeP處于同一進(jìn)化支，即CKPD與16SrⅠ-B亞組中的株系親緣關(guān)系較近，可推測(cè)CKPD為16SrⅠ-B亞組成員。

3討論

滇樸叢芽病在澄江和昆明等地大量發(fā)現(xiàn)，且呈現(xiàn)逐漸加重的趨勢(shì)，對(duì)顯癥的滇樸進(jìn)行大量調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其叢芽病狀明顯但無(wú)明顯病征，因此推測(cè)該病由植原體引起且尚未見有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本文通過(guò)掃描電鏡和16S rDNA序列分析，證明了滇樸叢芽病是由植原體引起，滇樸叢芽病植原體CKPD與芝麻變?nèi)~植原體SeP（KF728953）相似性高達(dá)99.40%，同時(shí)選取植原體16Sr組及亞組的代表菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定滇樸叢芽病植原體為16SrⅠ-B亞組成員，滇樸叢芽病屬國(guó)內(nèi)首次報(bào)道滇樸的一種植原體病害，為進(jìn)一步研究云南省植原體病害的種類提供了理論依據(jù)。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)及計(jì)算機(jī)技術(shù)的廣泛運(yùn)用，通過(guò)restriction fragment length polymorphism（RFLP）虛擬分析可獲得限制性酶切圖譜，不斷補(bǔ)充和完善植原體的遺傳信息，推動(dòng)了植原體的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)研究。據(jù)統(tǒng)計(jì)，植原體共有33個(gè)組，超過(guò)110個(gè)亞組和35個(gè)候選種。核糖體蛋白（riboso-mal protein）rp基因較16S rDNA基因有較大的變異，是進(jìn)一步劃分植原體類群的一個(gè)分子標(biāo)記。Martini等根據(jù)rp基因建立了19個(gè)植原體亞進(jìn)化支。延伸因子（elongation factor Tu，tuf）是植原體適應(yīng)和進(jìn)化的一個(gè)重要基因，其變異性更大，保守性更低，能夠體現(xiàn)不同植原體株系之問(wèn)變異性和多樣性。sec轉(zhuǎn)運(yùn)酶是被廣泛關(guān)注的原核生物蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)之一，分泌蛋白基因（secretary protein，secY）比16S rDNA基因具有更大的變異程度，在植原體同組及同亞組內(nèi)株系的精確劃分中更具有效性，secY基因的深入研究有助于了解植原體的致病機(jī)理及制定病害的有效預(yù)防措施。本研究只鑒定了澄江和昆明的滇樸叢芽病樣品，利用1179 bp的巢式PCR產(chǎn)物片段構(gòu)建亞組系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)自展支持率不高，在后續(xù)研究中可將巢式PCR產(chǎn)物純化后與載體連接導(dǎo)人感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆子，測(cè)序獲得大于1200bp的片段，通過(guò)RFLP分析結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹相互印證，驗(yàn)證CKPD準(zhǔn)確的亞組地位。

云南地形復(fù)雜、氣候條件良好，有較高的生物多樣性，為植原體及媒介昆蟲的適應(yīng)及進(jìn)化提供了有利的外界環(huán)境條件，同時(shí)，云南也成為植原體病害多發(fā)的地區(qū)。在云南已報(bào)道了多種由16SrⅠ組成員引起的植原體病害，其中16SrⅠ-B亞組成員在云南分布較廣，可以侵染多種植物，使寄主植物表現(xiàn)叢枝、扁莖及黃化等不同類型的癥狀。在自然條件下，寄主植物、植原體及媒介昆蟲構(gòu)成一個(gè)互作體系，植原體借助刺吸式口器昆蟲進(jìn)行傳播。在采集顯癥枝條時(shí)，發(fā)現(xiàn)植物幼嫩的枝條和葉片有大量的木虱為害，木虱若蟲集中在葉背刺吸植物汁液，想要證明木虱是否為滇樸叢芽病植原體的媒介昆蟲，需對(duì)為害滇樸的木虱進(jìn)行調(diào)查與收集，提取木虱總DNA，參照Folmer等設(shè)計(jì)的引物L(fēng)C01490/HC02198擴(kuò)增線粒體COI（細(xì)胞色素氧化酶I）基因加以驗(yàn)證。

目前，針對(duì)植原體病害還缺少成熟有效的防治技術(shù)，通過(guò)破壞病害三角與侵染循環(huán)，做到病蟲兼治，可有效防控植原體病害。首先，了解媒介昆蟲的生活史做到適時(shí)防治，選擇低毒緩效的殺蟲劑控制刺吸式口器昆蟲的數(shù)量;其次，利用四環(huán)素類抗生素對(duì)幼樹注射或澆灌，修剪時(shí)及時(shí)處理傷口;最后，加強(qiáng)人工管控，適地適樹，增強(qiáng)樹勢(shì)。今后，植物有益內(nèi)生菌的應(yīng)用、植物化感作用、脫毒苗的培育及導(dǎo)人抗性基因培育轉(zhuǎn)基因植株在植原體病害防控上有較大的潛力及應(yīng)用前景。