轉(zhuǎn)錄因子FOXA1 在非小細(xì)胞肺癌表達(dá)及與臨床病理特征之間的關(guān)系

薛興陽(yáng)，藍(lán)永權(quán),2，丁丹丹，吳華振,3，羅志明，趙健，孟江

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院胸外科，廣東廣州510095；2.梅州市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)二科，廣東梅州514000；3.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院/清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院腫瘤放療科，廣東清遠(yuǎn)511518；4.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006)

目前世界范圍內(nèi)的惡性腫瘤中，肺癌的發(fā)病率和死亡率高居榜首，其發(fā)病率占總病例的11.6%，死亡率占總病例的18.4%[1]。在我國(guó)，發(fā)病率和死亡率排名第一的惡性腫瘤目前也是肺癌[2]，其嚴(yán)重威脅著人們的健康，極大地增加了生活負(fù)擔(dān)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，新的肺癌治療手段不斷出現(xiàn)，尤其是分子靶向治療藥物的不斷涌現(xiàn)，極大地改善了中晚期患者的生存時(shí)間及生活質(zhì)量[3]。目前新的肺癌分子靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)仍是肺癌重要的研究領(lǐng)域之一。

轉(zhuǎn)錄因子是一類(lèi)非常重要的細(xì)胞內(nèi)調(diào)控因子，它能與上游特定序列特異性結(jié)合，促進(jìn)或抑制基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)特異性目標(biāo)蛋白表達(dá)[4]。細(xì)胞內(nèi)廣泛存在著多種轉(zhuǎn)錄因子，各轉(zhuǎn)錄因子可多樣性地調(diào)控其靶基因，并在腫瘤的生長(zhǎng)、分化、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥等多個(gè)方面起到至關(guān)重要的作用[5]。叉頭框蛋白A1(foxhead box A1,FOXA1)是一種在生長(zhǎng)發(fā)育、腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移中起著重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，它在不同的腫瘤中起著不同的作用[6]。生物信息學(xué)等研究顯示FOXA1 可能在肺癌發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[7]，但目前研究不多。因此，本研究檢測(cè)人非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）細(xì)胞株及人肺癌組織學(xué)樣本FOXA1表達(dá)并結(jié)合臨床病理特征探索FOXA1 在NSCLC 中的表達(dá)及意義，為FOXA1 成為肺癌的治療靶點(diǎn)提供前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究使用的NSCLC 細(xì)胞株95C、95D、A549、H460、H1650 及PC9 由廣州醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所提供。組織標(biāo)本來(lái)源于保存于組織標(biāo)本庫(kù)的2012 年11 月至2014 年12 月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行連續(xù)手術(shù)治療的經(jīng)病理證實(shí)的NSCLC 患者的肺癌組織和癌旁組織，選擇組織量足夠研究的病例，所有肺癌患者術(shù)前均沒(méi)有接受腫瘤治療且有完整臨床資料。本研究所有患者均簽署使用其組織樣本知情同意書(shū)。獲取組織后立即置于液氮瓶中保存。最終有43 例患者組織標(biāo)本納入研究。

RMPI-1640（Gibco，美國(guó)）細(xì)胞培養(yǎng)；Trizol 試劑(Life technology，美國(guó))提取RNA；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒(Tiangen 有限公司)；PCR 引物設(shè)計(jì)合成(華大科技有限公司)；鼠抗人FOXA1 多克隆抗體（Santa cruz biotechnology，美國(guó)）。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Scientific，德國(guó)）；ABI 7500 Fast PCR儀(Applied Biosystem，美國(guó))；凝膠成像分析系統(tǒng)、電泳儀及蛋白轉(zhuǎn)印儀（BIO-RAD，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 肺癌細(xì)胞及肺癌組織標(biāo)本準(zhǔn)備方法 肺癌細(xì)胞的培養(yǎng)按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行，將足量生長(zhǎng)良好的細(xì)胞收集離心后裝入已編號(hào)的滅好菌的凍存管中，迅速放入液氮中冷凍，后將標(biāo)本轉(zhuǎn)移存放入-80 ℃的深低溫冰箱中保存并做好登記備用。肺癌組織采集首先觀察大體標(biāo)本，確認(rèn)腫瘤的位置、大小，同時(shí)注意鑒別周?chē)M織和壞死組織，手術(shù)標(biāo)本離體后應(yīng)在最短的時(shí)間內(nèi)取材(＜30 min)，把癌和癌旁組織切成直徑為0.5 cm 左右的組織塊，裝入已編好號(hào)的滅菌凍存管內(nèi)，迅速放入液氮中冷凍，后將標(biāo)本轉(zhuǎn)移入標(biāo)本盒存放在-80 ℃深低溫冰箱中長(zhǎng)期保存并做好登記備用。

1.2.2 RT-PCR 反應(yīng) Trizol 提取細(xì)胞及組織總RNA，紫外線分光光度計(jì)測(cè)量RNA 的濃度及純度，瓊脂凝膠電泳實(shí)驗(yàn)確定RNA 無(wú)明顯降解。引物由華大科技有限公司合成，引物序列：GAPDH 上游：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTG-3′，下游：5′-AGGGCC ATCCACAGTCTTC-3′；FOXA1 上 游：5′-AGGGCTG GATGGTTGTATTG-3′；下 游：5′-AGGCCTGAGTTC ATGTTGCT-3′。20 μL 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃15 min，95 ℃10 s ，60 ℃30 s，40 cycle。內(nèi)參選GAPDH cDNA，用2-△△CT法分析RT-PCR 的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Western blot 實(shí)驗(yàn) 預(yù)處理好的研缽中研磨組織，置入EP 管中加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，混勻，冰上超聲波裂解后放在4 ℃搖床上搖0.5 h，13 000 r/min 離心機(jī)離心15 min，上清即為提取的總蛋白，置入新的EP 管；BCA 蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。按45 μg 蛋白質(zhì)上樣量，積層膠及分離膠分別以80 V 及120 V 恒壓電泳；用濕轉(zhuǎn)法將蛋白從SDS-PAGE 轉(zhuǎn)到PVDF 膜上，用6%的脫脂奶粉室溫封閉2.5 h；加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，在水平搖床上用TBST 洗膜3 次，每次洗膜15 min；之后熒光二抗在室溫孵育1～2 h；再次在水平搖床上用TBST 洗膜3次，每次洗膜15 min。在暗室內(nèi)發(fā)光，用GAPDH 蛋白作為內(nèi)參照，目標(biāo)條帶灰度值采用凝膠圖像分析軟件分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 及GraphPad Prism 6 Demo 軟件完成。計(jì)量結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，定性資料組間比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FOXA1 mRNA在NSCLC細(xì)胞株中的表達(dá)

用RT-PCR檢測(cè)各肺癌細(xì)胞株中的FOXA1表達(dá)。結(jié)果顯示FOXA1 的mRNA在不同的NSCLC細(xì)胞株中有不同程度的表達(dá)，在H460細(xì)胞中表達(dá)最高，在95C細(xì)胞表達(dá)最低，在H460細(xì)胞的表達(dá)量是95C細(xì)胞的109倍，95D細(xì)胞的表達(dá)量是95C細(xì)胞的2.3倍（圖1）。

2.2 FOXA1 mRNA 在NSCLC 組織中的表達(dá)及其與不同臨床病理特征之間的關(guān)系

檢測(cè)43 例NSCLC 癌組織同癌旁組織中FOXA1 mRNA 的表達(dá)，其中C 為NSCLC 組織，NC 為癌旁組織。結(jié)果顯示在NSCLC 癌組織中FOXA1 mRNA 的表達(dá)為0.731 1±0.095 26，在癌旁組織的表達(dá)則為0.485 6±0.055 68，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖2）。通過(guò)分析PCR 結(jié)果將患者分為FOXA1 mRNA 高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析其表達(dá)與NSCLC患者臨床病理資料之間的內(nèi)在關(guān)系。結(jié)果顯示FOXA1 mRNA 在NSCLC 癌組織內(nèi)的表達(dá)和年齡相關(guān)，在年齡大于55歲患者中的表達(dá)明顯低于小于等于55 歲患者的表達(dá)（P＜0.05），與患者性別（P=0.331）、吸煙史（P=0.639）、家族史（P=0.641）、病理類(lèi)型（P=0.362）、腫瘤大?。≒=0.571）及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移（P=0.904）無(wú)明顯相關(guān)（表1）。

2.3 NSCLC 癌組織中FOXA1 蛋白的表達(dá)及其和不同臨床病理特征之間的關(guān)系

圖1 FOXA1 mRNA在不同NSCLC細(xì)胞株中的表達(dá)Figure 1 Expression of FoxA1 mRNA in different non-small cell lung cancer cell lines

43 例NSCLC 癌組織中有3 例提取到的組織蛋白不能滿(mǎn)足Western blot 實(shí)驗(yàn)條件。結(jié)果顯示40 例NSCLC 患者癌組織與癌旁組織中的FOXA1 蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異（圖3）。通過(guò)分析Western blot結(jié)果將患者分為FOXA1 蛋白高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析其表達(dá)與NSCLC 患者的臨床病理資料之間的關(guān)系。結(jié)果顯示FOXA1 蛋白與性別（P=0.592）、年齡（P=0.199）、吸煙史（P=0.5）、家族史（P=0.204）、病理特征（P=0.533）、腫瘤大?。≒=0.273）、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移（P=0.649）無(wú)明顯相關(guān)。

3 討論

圖2 FOXA1 mRNA在NSCLC癌及其癌旁組織中的表達(dá)Figure 2 Expression of FoxA1 mRNA in NSCLC and its adjacent tissues

表1 NSCLC 組織中FOXA1 mRNA 的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Correlation between FoxA1 mRNA expression and clinicopathological characteristics of NSCLC

FOXA1 作為FOXA 家族3 個(gè)成員中最早被發(fā)現(xiàn)的一員，也是目前研究較多的FOXA 成員。FOXA1基因定位于人染色體14q21.1位點(diǎn)上，其結(jié)構(gòu)包括N端的轉(zhuǎn)錄激活域，中間和DNA 相結(jié)合的FOX 域，C端和H3/H4 組蛋白相關(guān)的激活轉(zhuǎn)錄結(jié)合域[8]。FOXA1 常被稱(chēng)為先鋒轉(zhuǎn)錄因子，它可通過(guò)取代組蛋白H1及二甲基化H3賴(lài)氨酸4和DNA基因組去甲基化從而使與之相結(jié)合的致密染色質(zhì)區(qū)域打開(kāi)來(lái)協(xié)助其他轉(zhuǎn)錄因子激活下游基因表達(dá)[9]。研究表明多種癌癥中存在FOXA1的表達(dá)，但是在不同的腫瘤中其作用各不相同[10-12]。有研究報(bào)道86例肺腺癌的寡核苷酸芯片顯示，在37%（32/86）的分析腫瘤中，F(xiàn)OXA1 mRNA 的 表 達(dá) 升 高，在5 例FOXA1 高 表 達(dá)肺腫瘤組織中，有2例檢測(cè)到其基因擴(kuò)增，提示該基因在肺癌發(fā)生中具有潛在的致癌作用[13]。Sakaeda等[14]研究顯示FOXA1 在所有的小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、肺典型類(lèi)癌病理類(lèi)型的免疫組化檢查結(jié)果均呈陽(yáng)性。另有研究報(bào)道鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中FOXA1 陽(yáng)性率為34.7%，與腺癌標(biāo)本中的39.6%相當(dāng)，對(duì)于腦轉(zhuǎn)移，鱗狀細(xì)胞癌組織中FOXA1的表達(dá)（55.6%）略高于非匹配原發(fā)性鱗狀細(xì)胞癌組織（43.4%），結(jié)果顯示鱗狀細(xì)胞癌中FOXA1 的表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及不良生存率相關(guān)（P=0.039）[15]。有學(xué)者研究顯示NKX2-1 轉(zhuǎn)錄因子是人類(lèi)肺腺癌中擴(kuò)增最顯著的基因，是正常肺發(fā)育的調(diào)節(jié)因子，NKX2-1可以與叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子FOXA1 協(xié)同調(diào)控LMO3基因的表達(dá)，提示FOXA1可能在肺癌的發(fā)生發(fā)展中也起到調(diào)節(jié)作用[16]。Zhu 等[17]在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均表明，異位穩(wěn)定表達(dá)的miR-194 抑制NSCLC 細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這種抑制作用可通過(guò)重新引入miR-194 的功能靶點(diǎn)FOXA1而逆轉(zhuǎn)，表明miR-194 可通過(guò)靶向FOXA1 蛋白抑制NSCLC 細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移及增強(qiáng)化療敏感性。Li等[18]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染FOXA1小干擾RNA（siRNA）可降低H-INV A549細(xì)胞中FOXA1的表達(dá)，導(dǎo)致G0/G1期細(xì)胞周期停滯，降低H-INV A549 細(xì)胞的侵襲、遷移和增殖能力。上述的系列研究提示FOXA1 可能在肺癌發(fā)生、發(fā)展中有重要作用。

圖3 FOXA1蛋白在NSCLC組織及其癌旁組織中的表達(dá)Figure 3 Expression of FOXA1 protein in NSCLC and its adjacent tissues

本研究發(fā)現(xiàn)FOXA1 mRNA 在各肺癌細(xì)胞株表達(dá)量有顯著區(qū)別，高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株H460 細(xì)胞的表達(dá)顯著高于其他細(xì)胞，而侵襲能力高的95D 細(xì)胞[19]表達(dá)量是侵襲能力低的95C 細(xì)胞的2.3 倍。本研究檢測(cè)了NSCLC 及其癌旁正常組織的手術(shù)標(biāo)本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXA1 mRNA 在NSCLC 組織中的表達(dá)高于癌旁組織，而且年輕的患者的NSCLC 組織中的表達(dá)明顯高于年長(zhǎng)的患者。本研究提示FOXA1 可能在肺癌發(fā)生過(guò)程中起重要作用，但FOXA1蛋白檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)癌組織和癌旁組織區(qū)別及其在不同臨床病理特征間的差異。而也有研究者發(fā)現(xiàn)雖然胃癌細(xì)胞系中FOXA1 在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)高于正常胃細(xì)胞系，但在FOXA1 蛋白在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于正常胃組織[20]。這說(shuō)明可能存在mRNA 到翻譯之間的調(diào)節(jié)過(guò)程，其中存在相當(dāng)復(fù)雜的機(jī)制。由此看來(lái)還需要更多的研究才能進(jìn)一步明確FOXA1 在肺癌發(fā)生發(fā)展中所扮演的角色。

總之，多數(shù)研究及本研究均提示FOXA1在肺癌中可能起致癌基因作用。但是目前相關(guān)研究尚少，隨著對(duì)轉(zhuǎn)錄因子FOXA1 在肺癌研究中的進(jìn)一步深入，它在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用會(huì)越來(lái)越明晰，期望其成為肺癌的治療新靶點(diǎn)。