利用生物信息學(xué)探究IL4 在哮喘中的異常表達(dá)及其相關(guān)基因的功能作用

卓超洲，沈觀樂，雷朝君，余瑞林，梁杰，高嫵媚，魏艾

（深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東深圳518109）

支氣管哮喘是一種常見的疾病，我國成年人患病率約為1.24%[1]。并且隨著工業(yè)化發(fā)展，哮喘的發(fā)病率也在逐年上升[2]。哮喘的發(fā)病是多種炎癥細(xì)胞（嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等）共同參與、相互作用的結(jié)果[3]。白細(xì)胞介素家族是一類與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)中起重要作用。白細(xì)胞介素家族至少有40個(gè)成員，IL4則是其中一個(gè)[4]。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者的血清中IL4 水平顯著上升，可能與氣道炎癥相關(guān)[5]。但是目前對(duì)IL4 在哮喘中的調(diào)控機(jī)制尚不清楚，因此在本研究中，通過對(duì)GEO 數(shù)據(jù)庫中哮喘患者的轉(zhuǎn)錄組及甲基化數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，探究了IL4 及其相關(guān)基因在哮喘發(fā)生中的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)IL4可能是治療哮喘的潛在靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源及預(yù)處理

本研究所用到的測(cè)序數(shù)據(jù)均來源于公共數(shù)據(jù)庫——GEO（Gene Expression Omnibus，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。哮喘患者的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)集來源于：GSE27011和GSE40888[6-7]。DNA甲基化數(shù)據(jù)來源于GSE40736[8]。miRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)來源于GSE142237。LncRNA表達(dá)數(shù)據(jù)來源于GSE106230[9]。

1.2 差異表達(dá)lncRNA和miRNA分析

使用GSE106230 數(shù)據(jù)篩選哮喘患者顯著高表達(dá)的lncRNA，GSE142237 數(shù)據(jù)集篩選miRNA 顯著低表達(dá)的基因。差異表達(dá)分析用R 語言（version 3.6）的limma 包[10]，log2foldchange＞1，P＜0.05 的lncRNA被認(rèn)為是顯著高表達(dá)。log2foldchange＜-1，P＜0.05的miRNA被認(rèn)為是顯著低表達(dá)。

1.3 CeRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

IL4 與miRNA 互作信息來源于miRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/），miRNA 與lncRNA互作信息來源于StarBase3（http://starbase.sysu.edu.cn/）。IL4 相關(guān)的ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖用Cytoscape 進(jìn)行展示[11]。

1.4 基因富集分析

將GSE27011 數(shù)據(jù)集中的哮喘患者按照IL4 的表達(dá)量進(jìn)行從高到低排序。按照IL4 表達(dá)量的中位數(shù)將患者分為IL4 高表達(dá)組和低表達(dá)組。本研究用GSEA（version，4.0.3）軟件對(duì)表達(dá)矩陣進(jìn)行分析，采用c2.cp.kegg.v7.1.symbols.gmt 數(shù)據(jù)集，按照缺省參數(shù)設(shè)置進(jìn)行基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA），設(shè)定隨機(jī)組合次數(shù)為1 000，|NES|＞1，P＜0.05的基因集被認(rèn)為是顯著富集的。

1.5 基因功能分析

本研究將與IL4 呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)的基因分別進(jìn)行基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析。GO 分析用R 語言（version 3.6）的clusterProfiler 包[12]。KEGG 分 析 使 用 的 在 線 分 析KOBAS3（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/）。P＜0.05 被認(rèn)為是顯著富集的功能或者通路。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用R 語言（version 3.6）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。哮喘患者和正常人的IL4 表達(dá)量及甲基化水平比較采用獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)?；虮磉_(dá)之間的關(guān)系采用Pearson 相關(guān)性分析。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GEO數(shù)據(jù)樣本統(tǒng)計(jì)

GSE27011包含36例哮喘患者和18例正常人的白細(xì)胞mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)。GSE40888 包含65 例哮喘患者和40 例正常人的外周血單核細(xì)胞mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)。GSE40736包含97例哮喘患者和97例正常人的外周血單核細(xì)胞DNA 甲基化數(shù)據(jù)。GSE142237包含8 例哮喘患者和4 例正常人的支氣管上皮miRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。GSE106230包含9例哮喘患者和3例正常人的外周血lncRNA表達(dá)數(shù)據(jù)。

2.2 喘患者和正常人IL4差異比較

通過將哮喘患者和正常人的IL4 表達(dá)水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)患者中IL4 顯著高表達(dá)（P=0.042 8，圖1A）。哮喘患者和正常人的IL4 DNA 甲基化水平進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)患者中IL4 DNA 甲基化水平顯著降低（P=0.028 3，圖1B）。

表1 數(shù)據(jù)集及樣本分布情況Table 1 Data set and samples distribution

2.3 CeRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

ceRNA 網(wǎng) 絡(luò) 中，lncRNA 與mRNA 是 正 調(diào) 控 關(guān)系，miRNA與mRNA是負(fù)調(diào)控關(guān)系[13]，因此本研究利用GSE142237 數(shù)據(jù)集篩選了在哮喘患者中顯著下調(diào)的miRNA（50 個(gè)）。利用GSE106230 數(shù)據(jù)集篩選了在哮喘患者中顯著上調(diào)的lncRNA（26 個(gè)）。通過預(yù)測(cè)IL4 與miRNA 的互作關(guān)系、miRNA 與lncRNA的互作關(guān)系，最終得到一個(gè)包含4個(gè)miRNA、6個(gè)lncRNA 和IL4 的ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖2），表2 展示了這些lncRNA和miRNA的上調(diào)下調(diào)情況。

2.4 基因富集（GSEA）分析

圖1 哮喘患者和正常人IL4差異比較結(jié)果。Figure 1 Difference of IL 4 between asthmatic patients and normal people

GSEA 分析發(fā)現(xiàn)有19 條通路顯著富集在IL4 高表達(dá)患者中。如表3所示，高IL4患者富集的通路主要涉及代謝類通路和一些受體信號(hào)通路。對(duì)排名為前2的通路進(jìn)行了展示（圖3）。

表2 CeRNA網(wǎng)絡(luò)中miRNA和lncRNA差異表達(dá)分析結(jié)果Table 2 Differential expression analysis of miRNA and lncRNA in ceRNA network

2.5 IL4相關(guān)基因篩選

利用GSE27011 和GSE40888 兩個(gè)數(shù)據(jù)集中的哮喘患者基因表達(dá)矩陣，分別計(jì)算IL4 與其他基因表達(dá)的相關(guān)性。其中GSE27011 篩選到1 584 個(gè)顯著與IL4表達(dá)相關(guān)的基因（816個(gè)正相關(guān)，768個(gè)負(fù)相關(guān)）。GSE40888 篩選到7 690 顯著與IL4 表達(dá)相關(guān)的基因（5 119 個(gè)正相關(guān)，2 571 個(gè)負(fù)相關(guān)）。圖4 和圖5 分別對(duì)GSE27011 和GSE40888 2 個(gè)數(shù)據(jù)集相關(guān)性最強(qiáng)的前4 個(gè)基因進(jìn)行了展示。將2 個(gè)數(shù)據(jù)集篩選到的相關(guān)基因取交集，一共得到210 個(gè)基因（144正相關(guān)，66負(fù)相關(guān)，圖6）。

表3 IL4高表達(dá)患者顯著富集的通路Table 3 Pathways enriched by IL4-overexpression patients

圖3 IL4高表達(dá)患者富集的top2通路Figure 3 Top 2 pathways enriched by IL4-overexpression patients

2.6 IL4功能及通路分析

選取與IL4 正相關(guān)的基因集進(jìn)行GO 和KEGG富集分析，以此來分析IL4 表達(dá)所促進(jìn)的功能（圖7A）或通路（圖7C）。在分子功能（biological process，BP）方面，主要與一些蛋白結(jié)合或者磷酸酶活性有關(guān)，例如：蛋白激酶B結(jié)合、激活素結(jié)合、跨膜受體蛋白酪氨酸磷酸酶活性、跨膜受體蛋白磷酸酶活性等；在細(xì)胞成分（cellular component，CC）方面，參與構(gòu)成一些細(xì)胞器，例如反式高爾基網(wǎng)囊泡的網(wǎng)格蛋白外套、跨高爾基網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)運(yùn)囊泡膜、內(nèi)溶酶體膜等；在生物學(xué)過程（molecular function，MF）方面，主要參與一些通路的調(diào)節(jié)作用，如：輔助性T-helper2 細(xì)胞分化的調(diào)控、前列腺素生物合成過程的調(diào)控、谷氨酸分泌的正調(diào)節(jié)等。在KEGG 通路方面，主要參與一些代謝通路，如甘油磷脂代謝、花生四烯酸代謝；一些重要物質(zhì)的合成，如：氨酰-tRNA 生物合成、甾體激素生物合成、泛酸和輔酶A 生物合成和初級(jí)膽汁酸生物合成；另外還參與一寫信號(hào)傳導(dǎo)通路，如：mTOR 信號(hào)通路、幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和甲狀腺激素信號(hào)通路。選取與IL4 負(fù)相關(guān)的基因集進(jìn)行富集分析，以此來分析IL4 表達(dá)所抑制的功能（圖7B）或通路（圖7D）。在分子功能方面，主要與一些蛋白結(jié)合或者磷酸酶活性有關(guān)，如泛素化類修飾依賴蛋白質(zhì)結(jié)合、長春新堿結(jié)合、泛素-泛素連接酶活性、磷脂酰肌醇磷酸激酶活性和NAD 依賴性組蛋白脫乙酰酶活性（H3-K14 特異性）等。在細(xì)胞成分方面，參與構(gòu)成DNA 復(fù)制因子A 復(fù)合體、核酸復(fù)制顆粒、樹突棘膜、黑素體膜和殼質(zhì)體等。在生物學(xué)過程方面，主要參與一些通路的調(diào)節(jié)作用，如：eIF2α 磷酸化對(duì)翻譯起始的調(diào)控、ATF6 介導(dǎo)的未折疊蛋白反應(yīng)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白輸出的負(fù)調(diào)控和蛋白質(zhì)多泛素化的負(fù)調(diào)控等。在KEGG 通路方面，主要參與一些基本生命活動(dòng)的通路，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工、醛固酮合成與分泌、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解和加壓素調(diào)節(jié)的水重吸收和粘蛋白型O-聚糖生物合成等。

圖4 GSE27011數(shù)據(jù)集中與IL4相關(guān)性最強(qiáng)的前四個(gè)基因。Figure 4 Strongest four genes correlated with IL4 in GSE27011 data set

圖5 GSE40888數(shù)據(jù)集中與IL4相關(guān)性最強(qiáng)的前4個(gè)基因。Figure 5 Strongest four genes correlated with IL4 in GSE40888 data set

圖6 GSE27011和GSE40888兩個(gè)數(shù)據(jù)集中與IL4呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)基因交集Figure 6 Intersection of positive and negative correlation genes with IL4 between GSE27011 and GSE40888 data sets

圖7 基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）分析Figure 7 Gene Ontology(GO)and Kyoto Encyclopedia of Genes(KEGG)analysis

3 討論

DNA 的甲基化修飾可引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，從而調(diào)控基因的表達(dá)，在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[14]。本研究中，通過比較哮喘患者和正常人的IL4 基因位點(diǎn)上DNA 甲基化水平，發(fā)現(xiàn)哮喘患者的IL4甲基化水平顯著降低，而IL4在哮喘患者中的表達(dá)水平顯著上升，因此推測(cè)，IL4 DNA 甲基化水平的降低促進(jìn)了IL4的表達(dá)。

目前越來越多研究表明，lncRNA 可以與mRNA競爭性與miRNA 結(jié)合，從而調(diào)控mRNA 的表達(dá)[13]。這類調(diào)控機(jī)制的失衡可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此，本研究建立了IL4 相關(guān)的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)，以探究相關(guān)的調(diào)控機(jī)制。網(wǎng)絡(luò)中的OIP5-AS1 已被報(bào)道可以作為哮喘的診斷標(biāo)記物[15]，hsa-miR-125b-5p 也被報(bào)道與IL4的表達(dá)具有一定的相關(guān)性[16]。網(wǎng)絡(luò)中l(wèi)ncRNA和miRNA 的調(diào)控可能導(dǎo)致了哮喘患者IL4 的異常表達(dá)。

GSEA 分析發(fā)現(xiàn)高IL4 表達(dá)水平的患者富集的大多為代謝相關(guān)的通路，其中糖代謝、亞油酸、花生四烯酸、谷胱甘肽及各種氨基酸代謝已被報(bào)道過在哮喘患者中及健康對(duì)照中存在顯著差異[17]。

通過對(duì)IL4 正相關(guān)的mRNA 進(jìn)行通路分析，發(fā)現(xiàn)這些mRNA 所在的一些通路與哮喘發(fā)生相關(guān)，例如：花生四烯酸代謝通路被發(fā)現(xiàn)與哮喘急性發(fā)作相關(guān)[18]；內(nèi)吞作用，細(xì)胞膜上重要結(jié)構(gòu)蛋白caveolin-1參與細(xì)胞的內(nèi)吞作用，該蛋白也被報(bào)道可作用于中氣道平滑肌細(xì)胞，與哮喘的發(fā)病相關(guān)[19]；幽門螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，幽門螺桿菌感染被發(fā)現(xiàn)與兒童哮喘發(fā)病呈正相關(guān)性[20]；甘油磷脂代謝通路，甘油磷脂被發(fā)現(xiàn)在哮喘組小鼠與對(duì)照組小鼠有顯著差異[21]；mTOR 信號(hào)通路在哮喘鼠模型中可參與肺組織炎性浸潤和氣道重塑等病理過程而介導(dǎo)哮喘的發(fā)生[22]；甲狀腺激素信號(hào)通路，甲狀腺激素被報(bào)道可增強(qiáng)哮喘患者的氣道平滑肌重構(gòu)[23]。對(duì)于與IL4 呈負(fù)相關(guān)的mRNA，其富集的通路，也與哮喘相關(guān)，例如：自噬，自噬在支氣管哮喘的發(fā)病過程中可能既有保護(hù)作用，又有損害作用[24]；泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路，paucigranulocytic 哮喘中發(fā)現(xiàn)一些顯著高甲基化的基因，這些基因富集于泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路[25]。

本研究通過應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析哮喘患者和正常人的轉(zhuǎn)錄組及甲基化數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)IL4 在哮喘中顯著高表達(dá)，并探究了其異常表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)IL4 的高表達(dá)可能導(dǎo)致與哮喘相關(guān)的代謝異常。另外本研究還挖掘出與IL4 表達(dá)相關(guān)的mRNA，發(fā)現(xiàn)這些mRNA 可能通過調(diào)控一些相關(guān)通路參與哮喘的發(fā)病。本研究從多組學(xué)多角度研究了IL4 的異常表達(dá)及其相關(guān)基因?qū)ο恼{(diào)控作用，研究顯示IL4可能可以作為哮喘治療的靶點(diǎn)。