串錢柳間苯三酚衍生物抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性研究

紀(jì)翠芳，李歡，曾玉虹，吉訓(xùn)戀

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院，海南?？?70208)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）是導(dǎo)致燒傷感染、術(shù)后創(chuàng)傷感染、燙傷樣皮膚綜合征等軟組織感染的主要致病菌[1-2]，具有多重耐藥性、感染率高及致死率高等特點[3]，是醫(yī)院感染的重要病原菌之一[4]，所以被稱為“超級細菌”。該類菌株不僅對青霉素類抗生素耐藥，還能在一定程度上對四環(huán)素類和大環(huán)內(nèi)酯類等抗生素耐藥[5]，其耐藥性與抗生素的使用劑量呈正相關(guān)，尚無有效遏制這一趨勢的藥物[6]。目前臨床上將萬古霉素作為一線抗MRSA 感染的藥物，但由于萬古霉素有較大的腎毒性，而且還有部分金黃色葡萄球菌出現(xiàn)了對萬古霉素中度耐藥甚至完全耐藥的現(xiàn)象[7]，故萬古霉素對MRSA 不是萬能的，尋找新的能抑制MRSA的抗生素迫在眉睫。

串錢柳（Callistemon viminalis），又名垂枝紅千層，系桃金娘科紅千層屬植物[8-9]。鑒于文獻報道桃金娘科植物含有強抗菌活性[10-12]的化學(xué)成分，尤其是間苯三酚類化合物，例如廣為熟悉的間苯三酚rhodomyrtone更是具有潛在的抗MRSA活性，最低抑菌濃度（MIC）為0.39 mg/mL[13]。而在Leejae 等[14]的深入研究rhodomytone 對抗生素耐藥病原菌的抗菌機制中，發(fā)現(xiàn)rhodomytone 對病原菌的主要作用靶點不在細胞膜和細胞質(zhì)中，這提示間苯三酚類化合物極有可能對包括MRSA在內(nèi)的抗生素耐藥病原菌擁有新的作用靶點。因此，本文對串錢柳植物中已分離鑒定的間苯三酚類化合物2,6-dihydroxy-4-methoxyisobutyrophenone（1）和2,6-dihydroxy-4-methoxyisovalerophenone（2）進行抗MRSA 活性評價，并進一步探討其抗MRSA作用機制。

1 材料與方法

1.1 植物與試劑

串 錢 柳(Callistemon viminalis) 15 kg，2018 年4月，采集于海南省?？谑?，標(biāo)本號No.20180401。

MTT 噻唑蘭，美國Sigma 公司；叔丁基過氧化氫(t-BHP),成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司；柱層析硅膠，200～300 目、300～400 目硅膠均為青島海洋化工廠；TLC 預(yù)制薄層板（HSGF254），德國Merck 公司；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20：Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden；MCI 樹 脂：CHP20P(75～150 μm),Mitsubishi Chemical Corporation 生產(chǎn)；96 孔細胞培養(yǎng)板，美國CORNING 公司；胎牛血清(FBS)，澳大利亞Gibco公司；青-鏈霉素(P/S),Thermo公司；DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，德國Biological Industries 公司；DMSO 溶液，美國Sigma 公司；HPLC分析用乙腈,Merck公司；實驗用水由美國Millipore公司純水、超純水系統(tǒng)提供；其他有機溶劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品；TLC顯色劑為5%香蘭素乙醇液。

1.2 主要儀器

質(zhì)譜：Waters 3100 SQDMS(低分辨ESI)；核磁共振譜：Bruker Avance Ⅲ500 型核磁共振儀，δ(ppm)，以氘代試劑殘留溶劑峰為內(nèi)標(biāo)；液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀：Waters 2695 LC 偶聯(lián)Waters Acquity ELSD、Waters 3100 SQDMS，分析色譜柱型號：Waters Sunfire?RP C18，3.5 μm,4.6 mm×100 mm；CO2細胞培養(yǎng)箱(上海力申科學(xué)儀器有限公司)；垂直超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)；低速離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)；MK3 型酶標(biāo)儀(美國Thermo fisher 公司)；超低溫冰箱(日本三洋SANYO 公司)；FM-500型倒置熒光生物顯微鏡(上海普丹光學(xué)儀器有限公司)；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 提取與分離

串錢柳枝葉15 kg，切斷后用95%（φ）酒精室溫浸泡3 次，每次7 d，合并提取液，減壓濃縮至無乙醇味。將獲到的總浸膏用水懸浮，然后用乙酸乙酯萃取，減壓條件下濃縮萃取液，得到乙酸乙酯部位（825 g）。首先，選用MCI 柱層析處理乙酸乙酯部位，以乙醇-水（50%、70%、95%乙醇）為流動相梯度洗脫，分別獲得組分A、B、C。隨后，采用硅膠柱層析（200～300 目）對組分A 進行處理，正己烷∶乙酸乙酯（10∶1～1∶1,V∶V）梯度洗脫，薄層色譜（TLC）檢測合并，獲到子組分A1～A9。子組分A3經(jīng)凝膠柱層析處理，甲醇洗脫，得到組分A3A～A3C；接下來對得到的子組分A3B 再進行硅膠（300～400 目）柱層析處理，正己烷∶乙酸乙酯（10∶1～1∶1,V∶V）洗脫，最后獲得化合物1（1.3 g）、化合物2（1.2 g）。

1.3.2 化合物1和2的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1，黃色粉末，ESI-MSm/z211.13[M+H]+，分子式C11H14O4(不飽和度Ω=5)。1H NMR(500 MHz,CDCl3):δH1.18(6H, d, 6.7 Hz, H-9,H-l0), 3.79(3H,s,CH3O),3.85(lH,sept,6.7 Hz,H-8),5.93(2H,s,H-3,H-5)。13C NMR(125 MHz,CD3OD):δC103.9(C-1),164.1(C-2),92.6(C-3),165.8(C-4),92.6(C-5),164.1(C-6),210.5(C-7),38.7(C-8),18.2(C-9),18.2(C-10),54.4(CH3O)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致，故鑒定化合物1 為2,6-dihydroxy-4-methoxyisobutyrophenone。

化合物2，黃色粉末，ESI-MSm/z225.15[M+H]+，分子式C12H16O4(不飽和度Ω=5)。1H NMR(500 MHz,CDCl3):δH0.97(6H,d,6.8 Hz,H-10,H-l1),2.25(lH,m,H-9),2.95(2H,d,6.8 Hz,H2-8),3.76(3H,s,CH3O),5.94(2H,s,H-3,H-5)。13C NMR(125 MHz,CDCl3):δC105.2(C-1),163.6(C-2),92.6(C-3),165.7(C-4),94.3(C-5),164.1(C-6),206.4(C-7),52.7(C-8),25.5(C-9),22.8(C-10),22.8(C-11),55.5(CH3O)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道基本一致，故鑒定化合物2 為2,6-dihydroxy-4-methoxyisovalerophenone。

1.3.3 體外抗菌活性評價

菌液制備方法：挑取MHA培養(yǎng)皿上單個菌落于10 mL MH 培養(yǎng)液中，搖床160 r/min、37 ℃條件下培養(yǎng)14 h。將待測菌液用MH 培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋，搖均勻后，600 nm 波長、l cm比色皿測定吸光度值A(chǔ)，根據(jù)A600吸光度值1 時，對應(yīng)細菌數(shù)量為1×109CFU/mL，將菌液濃度調(diào)整至1×106CFU/mL。

1.3.3.1 MIC與MBC測定實驗 化合物1和2分別用DMSO 做溶劑配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的溶液；陽性藥物萬古霉素用DMSO稀釋成1 mg/mL；刃天青顯色劑用雙蒸水配置成100 μg/mL；分別用0.22 μm孔徑的微孔濾膜過濾除菌，存于避光的棕色小瓶，4 ℃儲存。二倍稀釋法將最終樣品濃度與萬古霉素的濃度依次為100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL、3.12 μg/mL、1.56 μg/mL、0.78 μg/mL、0.39 μg/mL、0 μg/mL，然后將96 孔板在37 ℃下孵育18 h。通過顏色的變化來判斷藥物抗菌的MIC 值。根據(jù)2013 年CLSI 藥敏實驗規(guī)定，能夠殺死大于99.9%初始細菌含量的最低藥物濃度即為MBC 值。在讀取MIC 值后，分別移取各組藥物陰性孔（藍色生長孔）液體少許后用培養(yǎng)基，稀釋一定倍數(shù)，取50 μL稀釋后的菌液，涂菌棒均勻涂布于預(yù)先制好的MHA瓊脂平板上，將平板于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；取出平板讀取菌落個數(shù)，計算對應(yīng)孔內(nèi)細菌數(shù)量，確定MBC值。

1.3.3.2 Time-killing 曲線考察 取稀釋好的菌液（106～107CFU/mL）1.8 mL 于24 孔板中各個孔中，然后配制好的不同濃度化合物、萬古霉素和DMSO（陰性對照）與菌液于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育。在0 h、2 h、4 h、8 h、24 h分別吸取100 μL混合液，以MH為稀釋液，連續(xù)稀釋10倍稀釋，吸取稀釋后的菌液各5 μL，無菌接種環(huán)將菌液平鋪開來涂布于預(yù)先制好的MHA 瓊脂培養(yǎng)基平板上，將平板于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h；取出平板讀取菌落個數(shù)；以時間為橫坐標(biāo)，細菌數(shù)量對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制殺菌曲線，分析其動態(tài)殺菌效應(yīng)。

1.3.4 抗菌機制探討

1.3.4.1 細胞膜去極化實驗 37 ℃，取培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液，于4 000g，離心10 min，收集細胞，緩沖液洗滌3 次，制備A600為0.1 的菌懸液。將染色劑DiSC3-5加入細胞懸液中孵育，使染色劑終濃度為1 μmol/L，于30 ℃黑暗條件下培養(yǎng)20 min，直至吸收DiSC3-5。然后添加100 mmol/L KCl 溶液以平衡細胞質(zhì)和外部K+濃度。最后分別指定濃度的化合物，調(diào)零對照組Hepes緩沖液組，熒光分光光度計讀數(shù)。激發(fā)波長λex=660 nm、發(fā)射波長λem=675 nm。

1.3.4.2 SYTOX Green 實驗 核染色劑SYTOX Green用DMSO 配制成為濃度為3 mmol/L，避光保存于-20 ℃冰箱。陽離子核酸染料SYTOX Green 其本身基本不發(fā)出熒光，與核酸結(jié)合，能夠發(fā)出強熒光，相當(dāng)于自身發(fā)熒光強度的500倍。細胞膜受損時其細胞膜通透性發(fā)生改變，SYTOX Green 核酸染料能夠輕易穿透細胞膜。而活的細胞細胞膜功能完好，可以阻擋核酸染料。死細胞用SYTOX Green染色孵育一段時間，在488 nm 激發(fā)下發(fā)出熒光，SYTOX Green 熒光染色的方法可用于鑒定細胞懸浮液中的死活及總數(shù)。37 ℃，取培養(yǎng)至對數(shù)期的MRSA 于4 000g，離心10 min，收集細胞，用0.85% NaCl 緩沖液洗滌3 次，制備A600為0.2 的菌懸液，將其分別與8×MIC 濃度的化合物共同孵育，10 μg/mL 的蜂毒肽作陽性對照，與終濃度為3 μmol/L 的SYTOX green染料共同孵育5 min 激發(fā)波長λex=504 nm、發(fā)射波長λem=523 nm測量熒光。

1.3.4.3 掃描電鏡實驗 取培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液于4 000g，離心10 min，收集細胞，用緩沖液（0.85%NaCl）洗滌3 次，制備A600為0.2 的菌懸液，37 ℃下用分別用8×MIC 的化合物溶液處理4 h。將細胞洗滌2 次，懸浮在PBS 中，并在含有2%戊二醛和2.5%多聚甲醛的0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH=7.2）中過夜處理。用PBS洗滌6次后，將樣品在1%四氧化鋨中固定2 h。再用PBS 洗滌3 次后，將樣品通過分級乙醇（50%開始至100%）系列脫水，然后進行冷凍干燥至樣品中的脫水劑徹底揮發(fā)干凈。離子濺射法涂金，在掃描電子顯微鏡上拍照觀察。

2 結(jié)果

2.1 MIC與MBC測定結(jié)果

化合物1 和2 對MRSA JCSC4474 的MIC、MBC值見表1。

2.2 Time-killing曲線考察

結(jié)果如圖1 所示，當(dāng)分別用化合物1 和2 的8 倍MIC 濃度作用于MRSA JCSC4474，測試菌的存活量隨著時間的增加迅速減少，并在24 h 后降到極低點。

表1 化合物1和2對MRSA的MIC和MBC值Table 1 MIC and MBC of compounds 1 and 2 against MRSA

圖1 化合物1和2對MRSA JCSC4744的致死曲線Figure 1 Time-killing assay of MRSA JCSC4744 by compounds 1 and 2

2.3 抗菌機制探討

2.3.1 細胞膜去極化實驗

結(jié)果如圖2 所示，經(jīng)化合物1 和2 作用后，DiSC3-5探針的熒光強度明顯增強，呈現(xiàn)劑量濃度依賴性增大，表明化合物1 和2 在發(fā)揮抗菌活性時，會導(dǎo)致細菌細胞膜電勢去極化。

2.3.2 SYTOX Green實驗

實驗結(jié)果如圖3 所示，陽性對照熒光信號明顯升高；化合物1 和2 隨著作用時間的增加，熒光信號強度也隨之增加，但作用效果不如陽性對照明顯。

2.3.3 掃描電鏡實驗

結(jié)果如圖4a和圖4b所示，化合物1和2處理4 h后，細菌形態(tài)出現(xiàn)菌體大小不均，部分細菌破裂、變形，細菌表面出現(xiàn)皺縮等現(xiàn)象。

圖2 DiSC3-5探針下，化合物1 和2 對MRSA JCSC4744 細胞膜去極化Figure 2 Cytoplasmic membrane depolarization assay of MRSA JCSC4744 with compounds 1 and 2 by DiSC3-5 probe

圖3 化合物1和2對MRSA JCSC4744 的SYTOX green試驗Figure 3 SYTOX green assay of MRSA JCSC4744 with compounds 1 and 2

圖4 掃描電鏡下，化合物1（a）和2（b）作用MRSA JCSC4744 4 h后細菌細胞形態(tài)圖Figure 4 Cell morphology of MRSA JCSC4744 treated with compounds 1(a)and 2(b)for 4 h by scanning electron microscope

3 討論

隨著抗生素的使用[17]，萬古霉素的MIC 值呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，以致出現(xiàn)“MIC 漂移”的現(xiàn)象，為了減少耐藥菌株的出現(xiàn)，亟需尋找新的能抑制MRSA 的抗生素。研究報道，桃金娘科植物特征性化學(xué)成分間苯三酚類化合物具有顯著的抗MRSA活性。因此，從該科植物中尋求抗MRSA 先導(dǎo)化合物具有重要意義。而目前很多研究只是針對植物粗提物的抗菌活性，對單體化合物的活性研究尚少，本研究在對桃金娘科植物串錢柳的研究中，分離鑒定得到2 個間苯三酚類化合物，結(jié)構(gòu)鑒定為2,6-dihydroxy-4-methoxyisobutyrophenone(1)、2,6-dihydroxy-4-methoxyisovalerophenone(2)。

化合物1 和2 的MIC（表1）與Time-killing 曲線結(jié)果（圖1）顯示，化合物1和2對MRSA JCSC4474的MIC/MBC 值分別為25/50、6.25/100 μg/mL；且在24 h內(nèi)化合物1和2對MRSA均有持續(xù)殺菌效果，并與濃度成劑量依賴關(guān)系，因此化合物1和2對MRSA的殺菌效應(yīng)是迅速且徹底的。在細胞膜去極化實驗中（圖2），DiSC3-5探針的熒光強度明顯增強，表明化合物1 和2 在發(fā)揮抗菌活性時，會導(dǎo)致細菌細胞膜電勢去極化，據(jù)此推測化合物是通過破壞膜結(jié)構(gòu)而發(fā)揮抑菌活性的。在SYTOX Green 實驗中（圖3），盡管熒光信號強度增加不大，但仍可推測化合物1和2是通過作用于細菌細胞膜而發(fā)揮抗菌效應(yīng)。據(jù)此，細胞膜去極化實驗和SYTOX Green實驗結(jié)果揭示該2 個化合物的抑菌機制是通過破壞細菌的細胞膜而發(fā)揮抑菌活性的，同時該結(jié)果得到掃描電鏡實驗的驗證。

綜上所述，可知串錢柳植物中的間苯三酚類化合物擁有潛在的抗MRSA 活性，值得深入系統(tǒng)研究該類化合物，并從該類化合物中篩選出抗MRSA 活性更強的先導(dǎo)化合物。本研究還豐富了串錢柳植物的化學(xué)成分研究以及豐富間苯三酚類化合物的結(jié)構(gòu)類型，也為天然抗MRSA 藥物研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)和物質(zhì)基礎(chǔ)。