地塞米松對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型的作用及機(jī)制

靳珅，劉菲，王昱堃，劉博，譚文

(1.廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣州禾信儀器股份有限公司，廣東廣州510006;3.廣東省麥思科學(xué)儀器創(chuàng)新研究院，廣東廣州510006)

銀屑病是一種病因復(fù)雜且預(yù)后不良的慢性炎癥性皮膚病，嚴(yán)重時(shí)可累及多臟器[1-2]。我國(guó)銀屑病的患病率占全球1.25 億患者的50%，且近年來(lái)有明顯的增加趨勢(shì)[3]。臨床上診斷銀屑病的金標(biāo)準(zhǔn)為白色多層鱗屑、剝離后有薄膜現(xiàn)象和篩狀出血。銀屑病皮損部位組織病理學(xué)的表現(xiàn)為角化不全或角化過(guò)度，棘層增厚，真皮層內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[4-5]。目前針對(duì)銀屑病的治療大部分采用糖皮質(zhì)激素、卡泊三醇、維甲酸及免疫抑制劑結(jié)合一些物理方法來(lái)進(jìn)行對(duì)癥治療[6]，其中地塞米松作為一種人工合成的皮質(zhì)類固醇，在重度患者中或?qū)ζ渌委煙o(wú)效的情況下應(yīng)用較多，但其具體作用機(jī)制仍未十分明確，本文主要闡述了地塞米松對(duì)銀屑病的具體干預(yù)機(jī)制，為臨床用藥提供基礎(chǔ)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 FACS Celesta 型流式細(xì)胞儀（Becton,Dickinson 生命科學(xué)公司）；Centrifuge 5424R型臺(tái)式低溫離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司）；NU-4950E 型CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)NUAIRE 公司）；ProCyte Dx 型全自動(dòng)血液分析儀（愛德士?jī)x器有限公司）；Leica EG1150C型組織包埋機(jī)（德國(guó)萊卡科學(xué)儀器有限公司）；Leica RM2255 型旋轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)（德國(guó)萊卡科學(xué)儀器有限公司）；ST5020 型多功能染色機(jī)（德國(guó)萊卡科學(xué)儀器有限公司）；Tristar S LB942型多功能酶標(biāo)儀（德國(guó)Berthold公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只8～11周雌性SPF 級(jí)Balb/c小鼠購(gòu)于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）2013-0002，合格證編號(hào)為44007200057513，飼養(yǎng)在溫度為20～25°C，濕度40%～70%的環(huán)境中。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)所需抗體AF488-anti-mouse-CD3(B284975)、BV605-anti-mouse-CD4(B279163)、V711-anti-mouse-CD25(B101923)、BV510-anti-mouse-IL-17(B263584)、PE-anti-mouse-FoxP3 (B275698)等及試劑購(gòu)于美國(guó)Biolegend 公司；咪喹莫特乳膏購(gòu)于四川明欣利迪藥業(yè)有限責(zé)任公司；小鼠IL-17 ELISA試劑盒[EMC008(H).96]購(gòu)于深圳欣博盛生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及藥物處理 將30 只8～11 周雌性Balb/c 小鼠按照體質(zhì)量排序后根據(jù)隨機(jī)對(duì)照表平均分為空白對(duì)照（Ctrl）組、咪喹莫特模型（Pso）組、地塞米松（Dex）組，背部脫毛（4 cm×5 cm）后單籠飼養(yǎng)。Pso 組與Dex 組每天用62.5 mg 的5%咪喹莫特乳膏涂抹背部，Ctrl組涂抹凡士林[1,7]。每天灌胃1次，Ctrl組與Pso 組每天灌胃0.2 mL 生理鹽水，Dex 組按照1 mg/(kg·d)（0.2 mL）的劑量給藥。用盲法每天觀察小鼠皮膚狀態(tài)，同時(shí)進(jìn)行銀屑病皮損面積與嚴(yán)重度指數(shù)（PASI）評(píng)分[8]。連續(xù)觀察8 d，第9 天采集小鼠眼眶血，EDTA 抗凝后用動(dòng)物全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定小鼠五分類血的情況。處死小鼠后，在背部畫九宮格，選取小鼠第五格皮膚組織，經(jīng)固定、脫水、透明、包埋，切片后進(jìn)行HE 染色，觀察小鼠皮損部位組織病理表現(xiàn)，并采用銀屑病病理評(píng)分系統(tǒng)(Baker)進(jìn)行評(píng)分[9]，同時(shí)用Image J 軟件測(cè)量表皮厚度。收集各組小鼠脾臟進(jìn)行稱重并做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)小鼠脾臟中Th17 和Tregs 細(xì)胞的比例 研磨小鼠脾臟后，加入紅細(xì)胞裂解液制備小鼠脾臟單細(xì)胞懸液，取1×106個(gè)單細(xì)胞加入2 μL細(xì)胞激活劑（PMA+Ionomycin+BFA），在37 °C，5%（φ）CO2條件下刺激培養(yǎng)6 h[10]后，收集細(xì)胞，用TruStain fcX?冰上孵育20 min 進(jìn)行封閉。之后進(jìn)行小鼠脾臟細(xì)胞單管染色，首先各脾臟細(xì)胞中加入表面抗體CD3、CD4、CD25 冰上染色30 min，用PBS 清洗后進(jìn)行固定破膜。之后進(jìn)行染色胞內(nèi)抗體IL-17、FoxP3，冰上孵育30 min 后用1×Perm 溶液清洗，200目紗網(wǎng)過(guò)濾后檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)胞因子測(cè)量 取小鼠眼眶血，用肝素鈉抗凝后，2 000 r/min，4 ℃離心20 min，取上清液，測(cè)小鼠血清中IL-17的含量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以表示，采用GraphPad 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間差異采用單因素方差分析，兩組比較用Newman-Keuls 檢驗(yàn)方法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的皮膚形態(tài)學(xué)改變

如圖1A，與Ctrl 組相比，Pso 組小鼠出現(xiàn)銀屑病的典型皮膚改變：小鼠背部皮膚發(fā)紅明顯，皮膚呈斑塊狀，有大片鱗屑并伴隨丘疹出現(xiàn)；Dex 組有少量銀屑出現(xiàn)，小鼠皮損情況較Pso 組明顯減輕。如圖1B，由PASI評(píng)分可以看出，第1～7 天，隨著給藥時(shí)間的增加，無(wú)論是水腫情況、皮膚銀屑厚度還是疤痕情況，Dex組的評(píng)分都較Pso組更低。

2.2 各組小鼠的全身改變

如圖2，與Ctrl組相比，Pso組小鼠體質(zhì)量明顯降低，脾臟變大，脾指數(shù)變大（P＜0.05），Dex 組體質(zhì)量在第7、8天有回升，脾臟大小和質(zhì)量明顯降低，脾臟指數(shù)下降（P＜0.05）。

2.3 各組小鼠的皮膚病理學(xué)改變

如圖3A 所示，Ctrl 組小鼠背部皮膚從外到內(nèi)分別為表皮層、真皮層及皮下組織，皮膚層次分明，角質(zhì)層厚度正常，Pso 組小鼠皮膚角質(zhì)層內(nèi)出現(xiàn)Munro微膿腫，表皮層有明顯的角化過(guò)度和角化不全，棘層細(xì)胞層數(shù)變多、棘層肥厚。真皮層內(nèi)有炎癥細(xì)胞明顯，毛細(xì)血管擴(kuò)張，而給予地塞米松后，上述病理情況明顯改善。對(duì)小鼠皮膚背部HE 切片進(jìn)行組織病理學(xué)Baker評(píng)分，發(fā)現(xiàn)Pso組小鼠Baker評(píng)分為Ctrl組的7 倍，給予地塞米松后，Baker 評(píng)分降低到Ctrl組的5倍，評(píng)分降低明顯（P＜0.01）（圖3B）。通過(guò)Image J 測(cè)量小鼠表皮層的厚度，發(fā)現(xiàn)Pso 組小鼠表皮層厚度明顯增加，而Dex 組小鼠表皮厚度明顯降低（P＜0.01），見圖3C。

圖1 各組小鼠的臨床皮膚形態(tài)學(xué)改變(A)、PASI評(píng)分（B）Figure 1 Clinical skin morphological changes(A)and PASI score(B)of mice in each group

圖2 各組小鼠的全身改變Figure 2 Systemic changes of mice in each group

2.4 地塞米松治療小鼠咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣皮損的血液五分類情況

Pso 組白細(xì)胞總數(shù)明顯增多，其中較為明顯的是中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的增加（P＜0.05），而淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞的含量則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。Dex 組血液中白細(xì)胞總量降低，其中以中性粒細(xì)胞的降低更為明顯（P＜0.05）。

2.5 地塞米松對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣皮損的T細(xì)胞分型的影響

如圖5，Ctrl 組小鼠脾臟中Th 細(xì)胞（CD3+CD4+）的含量為40%左右，而Pso 組Th 細(xì)胞降低到10%左右，Th 細(xì)胞減少明顯（P＜0.05）；Dex 組Th 細(xì)胞比值恢復(fù)到20%（P＜0.05）。其中模型組Th17(CD4+IL-17+)明顯增加，Tregs 細(xì)胞（CD4+CD25+FoxP3+）減少（P＜0.05）。而Dex 組Th17 的比例與Pso 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而Tregs細(xì)胞比例明顯增多（P＜0.05）。

圖3 各組小鼠背部皮膚的組織病理學(xué)染色Figure 3 Histopathological staining of back skin of mice in each group

圖4 小鼠全血五分類血細(xì)胞表達(dá)Figure 4 Expression of five kinds of blood cells in mouse blood

2.6 地塞米松對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠血清中細(xì)胞因子IL-17的影響

如圖6，通過(guò)咪喹莫特誘導(dǎo)后，Pso 組小鼠血清中IL-17 的含量與Ctrl 組相比明顯增加（P＜0.05），為Ctrl 組的6 倍左右。Dex 組IL-17 的含量為Ctrl 組的2.3倍左右（P＜0.05），含量較Pso組顯著降低。

3 討論

本研究采用咪喹莫特單次給藥7 d 來(lái)建立小鼠銀屑病模型，從小鼠皮損部位改變、PASI評(píng)分趨勢(shì)圖以及皮損部位組織病理學(xué)改變以及Baker 評(píng)分可以看出，單次給藥7 d可以很好地模擬銀屑病臨床急性期的情況，第8天各項(xiàng)評(píng)分下降，說(shuō)明IMQ 誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣模型有時(shí)間窗的限制，可以認(rèn)為第7 天為疾病發(fā)生的高峰期，這與趙京霞等的研究相符[11]。

在實(shí)驗(yàn)中，隨著造模時(shí)間的增加，小鼠全身反應(yīng)癥狀明顯，如毛色發(fā)暗、體質(zhì)量下降、精神萎靡。Pso 組小鼠的脾指數(shù)約為Ctrl 組的2～3 倍，說(shuō)明咪喹莫特可以使小鼠免疫系統(tǒng)失衡，從PASI評(píng)分以及組織病理學(xué)觀察和Barker評(píng)分可以看出地塞米松可以有效緩解小鼠脾臟的腫大，降低自身免疫反應(yīng)的發(fā)生，對(duì)銀屑病小鼠有明顯的治療作用。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定小鼠脾臟T細(xì)胞Figure 5 Determination of T cells in mouse spleen by flow cytometry

圖6 各組小鼠血清中IL-17細(xì)胞因子的表達(dá)水平Figure 6 Levels of IL-17 in serum of mice in each group

為了探討地塞米松對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣皮損的作用機(jī)制，本研究對(duì)不同組小鼠全血的白細(xì)胞進(jìn)行了分類計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)地塞米松可以明顯降低中性粒細(xì)胞的數(shù)目，這與組織病理學(xué)中Dex 組角質(zhì)層中由中性粒細(xì)胞聚集形成的Munro微膿腫的數(shù)目明顯減少一致。進(jìn)一步研究了不同組小鼠全血中Tregs 細(xì)胞的含量，發(fā)現(xiàn)地塞米松可以增加Th輔助細(xì)胞向Tregs細(xì)胞轉(zhuǎn)化。研究表明，特異性表達(dá)Foxp3 的Tregs 細(xì)胞作為一種高效的免疫抑制物來(lái)抑制自身過(guò)敏性反應(yīng)，在維持機(jī)體正常免疫應(yīng)答中具有重要的意義。文獻(xiàn)報(bào)道，給裸鼠轉(zhuǎn)移缺少Tregs細(xì)胞的小鼠T細(xì)胞會(huì)誘導(dǎo)裸鼠產(chǎn)生多種自身免疫性疾病，Tregs細(xì)胞的增多是抑制自身免疫性疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素[13-14]。推測(cè)地塞米松的治療作用可能是通過(guò)增加Th 細(xì)胞向Tregs 細(xì)胞轉(zhuǎn)化而實(shí)現(xiàn)的。雖然Dex 組并不降低小鼠脾臟中Th17 細(xì)胞的比例，但血液中IL-17 的含量是降低的，IL-17 的降低可能是因?yàn)榈厝姿山档土搜豪镏行粤＜?xì)胞的水平，從而減少了中性粒細(xì)胞對(duì)IL-17 的分泌，IL-17 的減少又可以負(fù)調(diào)控多種炎癥因子，進(jìn)而減少對(duì)中性粒細(xì)胞的募集和活化，進(jìn)一步緩解銀屑病的發(fā)生[12]。

綜上所述，地塞米松緩解了由咪喹莫特誘導(dǎo)的T 細(xì)胞功能紊亂，增加Tregs 細(xì)胞的比例，同時(shí)降低血液中IL-17 的含量，從而緩解銀屑病樣皮損的情況。本文主要從銀屑病小鼠脾臟Th 細(xì)胞的變化層面闡述了地塞米松對(duì)銀屑病的干預(yù)機(jī)制，為臨床用藥提供基礎(chǔ)支持。后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步明確地塞米松主要是通過(guò)具體哪條代謝通路來(lái)影響趨化因子和免疫細(xì)胞的表達(dá)從而來(lái)干預(yù)銀屑病的發(fā)生。