白細胞介素-38對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化作用及機制研究

魏輝 李慧 余國華 董素娟 朱衛(wèi)芳

1天門市第一人民醫(yī)院（湖北天門431700）；2武漢科技大學職業(yè)危害識別與控制湖北省重點實驗室（武漢430065）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種由脂質(zhì)代謝紊亂和免疫反應失衡引起的動脈管壁的慢性炎癥性疾病，是嚴重危害人類健康的主要致死或致殘的疾病之一。AS 病理機制復雜，其中炎癥與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關［1-2］。大量的免疫細胞、免疫介質(zhì)參與動脈粥樣硬化的發(fā)生過程。促炎細胞因子如IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）參與動脈粥樣硬化斑塊形成［3-4］。白細胞介素（interleukin，IL）-38 是IL-1 家族成員，與IL-1拮抗劑（IL-1 receptor antagonist，IL-1Ra）和IL-36Ra的氨基酸同源，能夠與IL-36 受體特異性結(jié)合，誘導下游信號通道，達到抗炎作用［5-6］。YANG 等［7］研究表明，IL-38 能夠有效抑制ox-LDL 誘導的內(nèi)皮細胞炎癥。高脂血癥患者給予阿托伐他汀后導致了IL-38 水平升高，這表明IL-38 可能對高脂血癥的治療有一定保護作用。此外，在冠心病患者動脈粥樣硬化的板塊中發(fā)現(xiàn)IL-38 mRNA 表達。這些研究提示，IL-38 在心血管疾病中起著重要作用。目前，抗炎治療已經(jīng)成為防治動脈粥樣硬化的一種新途徑［8］。ApoE-/-小鼠的病理改變類似于人類Ⅱ型高脂血癥，利用ApoE-/-小鼠建立AS 模型，能觀察到粥樣斑塊發(fā)展的不同階段，且與人類AS 病變特征十分相似。本研究旨在探討外源重組IL-38 對小鼠AS 的影響及機制，為新型抗炎治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器具有C57BL/6遺傳背景的ApoE-/-小鼠購買于北京華阜康，血漿膽固醇、三酰甘油檢測試劑盒（南京建成），斑塊染色（0.3%油紅O 染色液），組化α-SAM、CD68、CD4、MMP-2 和MMP-9抗體（武漢塞維爾生物），流式抗體CD4-FITC、IFNγ-PE、IL-17a-PE、CD25-APC、Foxp3-PE、CD11-b-TITC、F4/80-APC、CD206-PE（eBioscience）、ELISA試劑盒IFN-γ、IL-17、IL-10 和TGF-β（銳博生物）小鼠IL-38 重組蛋白（Adipogen AG）。多功能酶標儀為Bio-tek 品牌，流式細胞分析儀屬于BD LSRFortessa。

1.2 動物分組20 只雄性ApoE-/-小鼠，采用隨機數(shù)字法分為對照組和rIL-38 組（n= 10）。每組小鼠給予西方飲食飼料（膽固醇0.15%）。對照組予以腹腔注射PBS，rIL-38 組予以腹腔注射外源重組IL-38（2.5 mg/kg），并于第9、12、15、18 周的第1 天開始干預，連續(xù)5 d為1周期，共干預4周期。

1.3 血清膽固醇、甘油三酯檢測末次給藥后，小鼠禁食12 h。腹腔注射10%水合氯醛（按小鼠體質(zhì)量10 mL/kg）麻醉小鼠，經(jīng)內(nèi)眥靜脈取血并收集于1.5 mL EP 管中，4 ℃離心15 min（3 500 r/min），分離血清，儲存于-80 ℃冰箱。檢測時按總膽固醇（TC）、甘油三脂（TG）檢測試劑盒的標準操作說明書，檢測血清中TC、TG 水平。

1.4 動脈粥樣硬化斑塊面積檢測將主動脈固定于4%多聚甲醛組織固定液中，經(jīng)過脫水、包埋、制片、油紅O 染色，用顯微鏡觀察主動脈的斑塊脂質(zhì)堆積情況。利用主動脈根部連續(xù)冰凍切片法（約7 μm），計算三個主動脈瓣環(huán)位置染色區(qū)域面積之和，從主動脈竇出現(xiàn)到主動脈竇消失的切片過程中，每隔50 μm 選取1 張切片做分析，總共計算五個切面，并用病理圖像分析軟件測量總形態(tài)病變面積（以μm2/切片為單位）。

1.5 斑塊穩(wěn)定性檢測切片取材于油紅染色的切面以下約7 μm 的連續(xù)組織切面，做α-SAM、CD68、CD4+T 細胞、MMP-2 和MMP-9 免疫組織化學染色和膠原纖維成份的Masson 染色。采用Image pro-Plus 6.0 分析計算陽性百分率。斑塊穩(wěn)定性=（α-SAM面積+膠原面積）/（巨噬細胞面積+油紅面積）。

1.6 流式細胞儀檢測Th1、Th2、Th17、Treg 和巨噬細胞比例取各組小鼠脾臟組織制作淋巴細胞懸液，依據(jù)流式細胞術操作說明書方法，分別檢測CD4+IFNγ+細胞（Th1）、CD4+IL-4+細胞（Th2）、CD4+IL-17+細胞（Th17）和CD4+CD25+Foxp3+細胞（Treg）占CD4+T 細胞數(shù)比例和CD11b+F4/80+CD206+（M2）占CD11b+F4/80+（巨噬細胞）比例。

1.7 酶聯(lián)免疫法檢測小鼠血漿各細胞因子的水平麻醉小鼠后，經(jīng)內(nèi)眥靜脈取血，用無菌管盛裝，常溫以1 500 rpm 離心10 min 后取血漿，保存于-80 ℃冰箱中。采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定IFN-γ、IL-17、IL-10 和TGF-β濃度。

1.8 統(tǒng)計學方法應用SPSS 22.0 進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 rIL-38對小鼠動脈粥樣硬化斑塊的影響對兩組小鼠進行油紅O 染色計算斑塊面積，與對照組相比，rIL-38 組使主動脈斑塊面積減少達33.5%，差異 有統(tǒng)計學意義［（161.0 ± 35.53）vs.（242.1 ±43.28），P＜0.01）］，見圖1。結(jié)果表明，外源rIL-38能顯著減少動脈粥樣硬化斑塊面積。

圖1 rIL-38 對ApoE-/-小鼠主動脈粥樣硬化面積的影響Fig.1 Effects of rIL-38 on atherosclerotic lesion in ApoE-/-mice

2.2 rIL-38 對小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響rIL-38 組斑塊內(nèi)膠原以及α-SAM 含量明顯高于對照組［膠原纖維：（47.15 ± 7.06）%vs.（30.14 ±6.47）%，α-SAM：（22.53±5.01）%vs.（13.26±4.63）%，均P＜0.05］，CD68 和CD4+T 細胞含量明顯少于對照組，提示泡沫化被抑制［CD68：（20.31 ± 5.59）%vs.（30.76±6.97）%，CD4+T細胞：（67.21±20.36）/mm-2vs.（109.10±22.45）/mm-2，均P＜0.05］。與對照組相比，rIL-38 組主動脈竇基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9 含量也明顯減少［MMP-2：（9.46 ± 3.52）%vs.（23.13 ± 3.57）%，MMP-9：（15.36 ± 4.64）%vs.（28.77±8.16）%，均P＜0.05）］，見圖2。

圖2 rIL-38 對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effects of rIL-38 on Stability of atherosclerotic plaques in ApoE-/-mice

2.3 rIL-38 對小鼠體質(zhì)量、血脂的影響兩組小鼠體質(zhì)量、TC 和TG 水平差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。

表1 兩組小鼠體質(zhì)量、TC 及TG 的水平Tab.1 The levels of Weight，serum TC and TG in ApoE-/-mice ±s

表1 兩組小鼠體質(zhì)量、TC 及TG 的水平Tab.1 The levels of Weight，serum TC and TG in ApoE-/-mice ±s

注：與對照組比較，#P ＞0.05

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2.4 rIL-38 對脾臟免疫細胞的影響與對照組相比，rIL-38 組Th1、Th17 數(shù)量明顯減少，Treg 數(shù)量明顯升高［Th1：（15.64±1.31）%vs.（21.41±2.17）%，Th17：（0.73% ± 0.22）%vs.（2.26 ± 0.68）%，Treg：（11.54±1.31）%vs.（7.46±0.57）%，均P＜0.05）］，但Th2在兩組中無統(tǒng)計學差異［Th2：（1.64 ±0.25）%vs.（1.59±0.27）%，P＞0.05）］，見圖3。rIL-38 組M2 巨噬細胞比例明顯升高［M2：57.37% ±2.92%vs.%36.92%±4.21，P＜0.05］，見圖4。

2.5 rIL-38 對炎癥因子的影響與對照組相比，rIL-38 組血漿IFN-γ、IL-17 水平明顯減低，IL-10、TGF-β水平升高［IFN-γ：（227.7 ± 56.9）pg/mLvs.（425.5 ± 102.3）pg/mL，IL-17：（85.8 ± 47.1）pg/mLvs.（175.3±69.1）pg/mL，IL-10：（174.9±26.9）pg/mLvs.（72.5±36.8）pg/mL，TGF-β：（548.2±76.3）pg/mLvs.（309.3±82.4）pg/mL，均P＜0.05］，見圖5。

3 討論

IL-38 是新發(fā)現(xiàn)的IL-1 家族成員。IL-1 家族成員通過連接到炎癥細胞表面的IL-1 受體，誘導下游AP1 和NF-kB 等信號，進而誘導環(huán)氧合酶（iCOX）、一氧化氮（iNOS）合成和其他炎癥介質(zhì)的表達。IL-38 與IL-36Ra 同源度較高，也可發(fā)揮與IL-36Ra 類似的受體拮抗活性，抑制IL-36（α、β或γ）與IL-36R 結(jié)合，從而發(fā)揮抗炎作用［5，9］。IL-38還可以影響巨噬細胞以及Th17 細胞的相關炎癥因子（IL-17，IL-22，TNF-α等）的產(chǎn)生和分泌，從而在多種自身免疫性疾?。?0-11］和心血管疾?。?2-13］中發(fā)揮作用。本研究旨在探討rIL-38 對小鼠動脈粥樣硬化的影響，闡明其對斑塊面積、斑塊穩(wěn)定性、脾臟免疫細胞和血漿炎癥因子水平的作用。

圖3 rIL-38 對ApoE-/-小鼠脾臟T 細胞的影響Fig.3 Effects of rIL-38 on T cells in spleen of ApoE-/-mice

圖4 rIL-38 對ApoE-/-小鼠脾臟M2 巨噬細胞的影響Fig.4 Effects of rIL-38 on M2 macrophages in spleen of ApoE-/-mice

圖5 rIL-38 對ApoE-/-小鼠炎癥因子的影響Fig.5 Effects of rIL-38 on inflammatory factors in spleen of ApoE-/-mice

YANG 等［7］研究表明，高脂血癥患者的IL-38 mRNA 和血清蛋白水平高于健康對照組。體外實驗證實IL-38 能有效抑制外周血單個核細胞產(chǎn)生IL-6、IL-1β和CRP。在高脂血癥小鼠模型中，IL-38的過表達也能顯著抑制促炎因子的表達，減輕動脈粥樣硬化病變的形成。本研究發(fā)現(xiàn)，rIL-38 組ApoE-/-小鼠AS 斑塊面積顯著減少，但血清中TC、TG 水平未明顯下降，這表明rIL-38 對ApoE-/-小鼠AS 具有明顯保護作用，其作用機制并非通過降脂作用而是通過其他潛在的分子機制實現(xiàn)的。

本研究發(fā)現(xiàn)rIL-38 組小鼠粥樣斑塊內(nèi)膠原纖維和平滑肌細胞（α-SAM）含量明顯增加，而巨噬細胞（CD68）和CD4+T 細胞顯著減少，這表明斑塊穩(wěn)定性增加。據(jù)文獻報道［14-15］，MMP2/MMP9 在AS 發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用：可通過促進平滑肌遷移，降解細胞膠原及參與鈣質(zhì)沉著等方面，加速AS 進展。這種保護作用可能是通過抑制MMP2/MMP9來實現(xiàn)的。

Th 細胞是AS 斑塊中的主要適應性效應細胞。T 淋巴細胞是最早進入AS 斑塊的細胞之一。Th17/CD4+CD25+Foxp3+Treg 失衡已證實與AS 的發(fā)生、發(fā)展密切相關［16-17］。本研究表明，rIL-38 組小鼠脾臟Th1、Th17 數(shù)量明顯下降，炎癥因子IFN-γ、IL-17 水平顯著降低。一方面，IL-38 可能通過與IL-36 受體特異性結(jié)合，從而抑制IL-17 的表達；另一方面，IL-38 與IL-1Ra 拮抗活性的劑量效應相似，可能通過抑制IL-22 表達，共同抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，延緩AS 進程。MENG 等［14，18］發(fā)現(xiàn)ApoE-/-小鼠的AS 斑塊中，調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg）可以通過增加平滑肌細胞和膠原蛋白含量，減少促炎細胞因子的釋放和MMPs 的產(chǎn)生，從而降低斑塊破裂的風險。Treg 細胞通過介導細胞因子釋放來促進M1巨噬細胞向M2巨噬細胞轉(zhuǎn)化，通過其抗炎作用使斑塊穩(wěn)定性增加［19-20］。本研究結(jié)果顯示，IL-38 能顯著提高Treg數(shù)量，這可能與IL-38 能介導巨噬細胞向M2 型轉(zhuǎn)化有關，從而起到延緩AS 的作用。然而，本研究尚未驗證IL-38 在不同細胞系作用，其結(jié)果是否與動物試驗相一致，仍需進一步證實。

綜上所述，rIL-38 能有效抑制ApoE-/-小鼠的AS進程，減少了斑塊處促炎巨噬細胞，促進了斑塊的穩(wěn)定性。這種保護作用可能是通過抑制Th17/CD4+CD25+Foxp3+失衡，減少炎癥因子表達，促進巨噬細胞向M2 型轉(zhuǎn)化來實現(xiàn)的。