五味子甲素對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及作用機制研究

黃勝 龔蕊 劉贛贛 漆啟華 黃帥

1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科（南昌330006）；2江西衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系（南昌330052）；3廣州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科（廣州510260）

前列腺癌（prostate cancer，PCa）是發(fā)達國家中男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，是全球范圍內(nèi)男性發(fā)病率最高的腫瘤［1］。我國前列腺癌發(fā)病率也呈逐年上升趨勢。骨組織是前列腺癌最易發(fā)生轉(zhuǎn)移的部位，大約有84%晚期前列腺癌患者最終發(fā)生骨轉(zhuǎn)移［2］。目前，針對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的治療多為姑息性治療，主要包括以內(nèi)分泌治療和化療為主的全身治療，以及針對骨轉(zhuǎn)移的局部治療，如手術(shù)、放療、雙膦酸鹽和骨靶向治療等。盡管早期篩查，診斷技術(shù)提高和放化療降低了前列腺癌患者的死亡率，但治療癌癥的藥物所產(chǎn)生的副作用嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量。因此，尋找療效好、毒副作用小的理想藥物，對晚期前列腺癌的治療具有非常重要的意義，也是目前醫(yī)藥學(xué)研究的熱點。

五味子甲素（deoxyschizandrin）是從五味子中提取的一種木脂素類化合物，是中藥五味子的有效成分之一［3］。五味子甲素具有護肝、抗炎、抗凝血、防護腎損傷、抗抑郁及抑制胃腸平滑肌收縮等作用［4-6］。最新研究表明，五味子甲素在多種腫瘤治療方面有潛在的應(yīng)用價值，如甲狀腺癌［7］、腸癌［8］及乳腺癌［9］等。然而，五味子甲素對前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及作用機制仍不清楚。

miRNAs 是一類內(nèi)源性非編碼微小RNA（長約18-22nt），通過與靶基因3′-UTR 的miRNA 識別元件結(jié)合，轉(zhuǎn)錄后抑制或降解mRNA，從而在很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［10-12］。研究報道，五味子甲素的抗癌作用與miRNAs 的調(diào)控密切相關(guān)，如miR-155［9］、miR-195［8］和miR-429［7］等。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-505-3p 通過直接靶向SMAD2 和SMAD3，抑制TGF-β信號通路的活性，從而抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力［13］。因此，筆者推測五味子甲素是否通過調(diào)控miR-505-3p 來影響前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。因此，本研究旨在研究五味子甲素對PC-3 細(xì)胞體外增殖、遷移及侵襲的影響，并進一步探討其是否通過影響miR-505-3p 表達來調(diào)控TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制前列腺癌體外轉(zhuǎn)移，為五味子甲素在前列腺癌的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑人前列腺癌PC-3 細(xì)胞系購自美國模式菌種收集中心（ATCC）；五味子甲素購自武漢慧誠益通生物公司；6 周齡雄性BALB/c裸鼠購自中山大學(xué)實驗動物中心；RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國HyClone 公司；CCK-8 細(xì)胞活性檢測試劑盒和BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Tranwell 小室購自美國Millipore 公司；Matrigel 膠購自美國BD 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR 試劑盒購自廣州復(fù)能基因有限公司；Lipofectamine 2000 和miR-505-3p inhibitor 購于廣州銳博生物科技有限公司；SMAD2、SMAD3、pSMAD2/3、SMAD2/3 和GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；p84抗體購自美國Invitrogen。

1.2 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖將PC-3 細(xì)胞以每孔100 μL（2 × 104個/孔）接種于96 孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后加入濃度為0、5、10、20、40、80 μmol/L 的五味子甲素，每組設(shè)5 個復(fù)孔，孵育24 h 后每孔加入10 μL CCK-8 試劑，酶標(biāo)儀檢測波長在450 nm 處的吸光度值。用15 μmol/L 的五味子甲素處理PC-3細(xì)胞，分別培養(yǎng)0、1、2、3、5 d，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，多功能酶標(biāo)儀檢測各孔的吸光度值（450 nm）。

1.3 qRT-PCRTRIzol 試劑提取樣品的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成miRNA 和mRNA 的cDNA。隨后，使用RT-PCR 試劑盒在Bio-Rad CFX96TM上進行PCR 擴增。以U6 或GAPDH 為參照，用2-ΔΔCq法分析miRNA 和mRNA 的相對表達水平。所用引物序列如下：U6 上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-505-3p 上游引物：5′-CTACGTGGGTCACCCCCTC-3′，下游引物：5′-CCAAAGGAGACCTCGTAGT-3′；GAPDH 上游引物：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；IL-11 上游引物：5′-TGAAGACTCGGCTGTGACC-3′，下游引物：5′-CCTCACGGAAGGACTGTCTC-3′；PTHRP 上游引物：5′- ACTCGCTCTGCCTGGTTAGA-3′，下游引物：5′-GGAGGTGTCAGACAGGTGGT-3′；CTGF 上游引物：5′-GCTACCACATTTCCTACCTAGAAATCA-3′，下游引物：5′-GACAGTCCGTCAAAACAGATTGTT-3′。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染將PC-3 細(xì)胞接種于6 孔板中（3×105/孔），置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長融合至50%～60%，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染；按照制造商的說明使用Lipofectamine 2000 進行miR-505-3p inhibitor 的轉(zhuǎn)染。

1.5 Transwell 檢測細(xì)胞遷移及侵襲不同濃度的五味子甲素處理PC-3 細(xì)胞24 h 后，胰蛋白酶消化后重懸，將200 μL 細(xì)胞懸液（1×106個/mL）接種于Transwell 小室的上室，并將含10%FBS 的培養(yǎng)基加入下室，然后置入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室，用4%多聚甲醛固定并用結(jié)晶紫染色。濕棉簽小心擦去上室基底膜上表面的細(xì)胞，洗凈殘余的染色液，晾干，顯微鏡下隨機取五個視野中進行拍照及計數(shù)。不使用Matrigel 基質(zhì)膠覆蓋Transwell 細(xì)胞小室時檢測細(xì)胞遷移，而在使用Matrigel 基質(zhì)膠覆蓋Transwell 細(xì)胞小室的情況下檢測細(xì)胞侵襲。

1.6 Western blot 檢測將PC-3 細(xì)胞均勻接種于6 孔培養(yǎng)板中，24 h 細(xì)胞貼壁后，加入不同藥物濃度的五味子甲素處理48 h。RIPA 裂解液提取處理后細(xì)胞蛋白，并用BCA 法進行蛋白定量。通過10% SDS-PAGE 分離等量的蛋白，并將其轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，然后用5%脫脂奶粉封閉1.5 h。加入稀釋后的一抗，4 ℃孵育過夜，然后在TBST 洗滌后加入二抗，室溫孵育1 h。最后，ECL 法顯色曝光。

1.7 裸鼠成瘤模型及處理將0.2 mLPC-3 細(xì)胞（1 ×106個）接種于裸鼠背部皮下。待裸鼠腫瘤形成后，挑選瘤體積相近的裸鼠隨機分組，分為對照組和五味子甲素治療組，每組各6 只。其中對照組不給予任何藥物，每天給予正常飲食；五味子甲素治療組，予五味子甲素（500 mg/kg）灌胃給藥，1 次/2 d，給藥3 周后處死小鼠，剝離出瘤體組織，稱重后進行后續(xù)實驗。

1.8 免疫組化實驗將腫瘤組織切片后進行脫蠟處理，酒精梯度水化、抗原修復(fù)、內(nèi)源性過氧化物酶阻斷和山羊血清室溫封閉后，加入一抗。滴加標(biāo)記有HRP 的二抗，室溫孵育30 min，顯色劑顯色。蘇木精行細(xì)胞核復(fù)染，乙醇水化及二甲苯透明，中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下進行閱片和結(jié)果判定，并對免疫組化結(jié)果進行光密度分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法SPSS 19.0（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）用于統(tǒng)計學(xué)分析，所有的實驗均重復(fù)3 次以上，統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間差異比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五味子甲素對PC-3 細(xì)胞增殖的影響不同濃度的五味子甲素處理PC-3 細(xì)胞48 h 后，采用CCK-8 檢測細(xì)胞增殖情況。隨著五味子甲素濃度的升高，PC-3 細(xì)胞增殖受到抑制的程度越來越顯著（P＜0.01），且呈劑量依賴性（圖1A）。細(xì)胞增殖抑制率的IC50為15.74 μmol/L。將濃度為15 μmol/L的五味子甲素處理PC-3 細(xì)胞，檢測不同時間點（1、2、3、4、5 d）PC-3 細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果表明，與DMSO 對照組比較，五味子甲素處理2、3、4、5 d對PC-3 細(xì)胞的增殖抑制作用差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖1B）。

圖1 五味子甲素對PC-3 細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of deoxyschizandrin on proliferation of PC-3 cells

2.2 五味子甲素對PC-3 細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響Transwell 遷移及侵襲實驗結(jié)果顯示（圖2），與對照組相比，用不同濃度五味子甲素處理的PC-3 細(xì)胞48 h 后，細(xì)胞遷移及侵襲能力明顯受抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），并且這種抑制作用呈劑量依賴性。

2.3 五味子甲素對PC-3細(xì)胞miR-505-3p 和TGFβ信號通路的影響qRT-PCR 結(jié)果表明，與對照組相比，不同濃度的五味子甲素（5、10、15 μmol/L）處理PCa骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞48 h后，miR-505-3p的表達上調(diào)（P＜0.01），而SMAD2、SMAD3以及TGF-β信號傳導(dǎo)的下游靶基因（包括IL-11，PTHRP 和CTGF）的mRNA 表達均降低（P＜0.01），并呈濃度依賴性（圖3）。Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，五味子甲素（15 μmol/L）處理的PC-3 細(xì)胞細(xì)胞核中SMAD2/3 蛋白表達無顯著差異，而細(xì)胞核中pSMAD2/3 蛋白表達顯著降低（P＜0.01，圖4）。

2.4 下調(diào)miR-505-3p 逆轉(zhuǎn)五味子甲素對PC-3 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用為了進一步探討miR-505-3p是否參與五味子甲素對PC-3細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用，五味子甲素（15 μmol/L）處理miR-505-3p inhibitor 轉(zhuǎn)染的PC-3 細(xì)胞48 h，分別采用CCK-8 檢測細(xì)胞增殖、Transwell 檢測細(xì)胞遷移及侵襲情況。CCK-8 細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示（圖5A），與對照組相比，miR-505-3p inhibitor 轉(zhuǎn)染后PC-3 細(xì)胞增殖能力增強，且miR-505-3p inhibitor能夠逆轉(zhuǎn)五味子甲素對PC-3 細(xì)胞增殖的抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。Transwell 遷移及侵襲實驗結(jié)果顯示（圖5B、C），與對照組相比，miR-505-3p inhibitor 轉(zhuǎn)染后PC-3 細(xì)胞遷移及侵襲能力增強，且miR-505-3p inhibitor 能夠逆轉(zhuǎn)五味子甲素對PC-3 細(xì)胞遷移和侵襲的抑制作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。因此，抑制miR-505-3p 表達后，五味子甲素對PC-3 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的抑制作用明顯減弱。

圖2 五味子甲素對PC-3 細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響Fig.2 Effect of deoxyschizandrin on migration and invasion of PC-3 cells

圖3 五味子甲素對miR-505-3p 和TGF-β信號通路相關(guān)基因表達的影響Fig.3 Effect of deoxyschizandrin on the expression of miR-505-3p and TGF-β signaling pathway-related genes

圖4 五味子甲素對TGF-β信號通路相關(guān)蛋白表達的影響Fig.4 Effect of Deoxyschizandrin on the expression of TGF-β signaling pathway-related proteins

2.5 五味子甲素對荷瘤裸鼠的腫瘤抑制作用及miR-505-3p、SMAD2、SMAD3 表達的影響對荷瘤裸鼠的治療實驗結(jié)果顯示，對照組的腫瘤重量為（137.7±16.17）mg，而五味子甲素（500 mg/kg）組體積為（23.67 ± 23.67）mg，兩組腫瘤重量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖6B）。qRT-PCR 檢測結(jié)果表明，miR-505-3p在五味子甲素組表達水平顯著高于對照組組（P＜0.01，圖6C）。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示（圖6A、D、E），SMAD2 和SMAD3 蛋白在五味子甲素組表達水平顯著低于對照組（P＜0.01）。

圖5 下調(diào)miR-505-3p 對五味子甲素作用下PC-3 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響Fig.5 Effect of knockdown of miR-505-3p on proliferation，migration and invasion of PC-3 cells treated with deoxyschizandrin

圖6 五味子甲素對裸鼠移植瘤的生長抑制及miR-505-3p、SMAD2、SMAD3 表達的影響Fig.6 Effect of deoxyschizandrin on tumor growth and miR-505-3p、SMAD2、SMAD3 expression in nude mouse xenograft model

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是晚期前列腺癌患者的主要并發(fā)癥，84%患者最終死于腫瘤轉(zhuǎn)移，而骨轉(zhuǎn)移又是前列腺癌最常見的轉(zhuǎn)移部位［2］。目前，針對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的治療多為姑息性治療，總體治療效果并不盡如人意。因此，亟待尋找療效好、毒副作用小的藥物，來緩解晚期前列腺癌患者的痛苦。研究報道，多種中藥成分具有抗腫瘤作用，且毒副作用小，已被證明是非常有前景的癌癥治療藥物。目前，多種中藥及其有效成分展示了良好的抗前列腺癌活性，如松杉靈芝提取物抑制轉(zhuǎn)移性前列腺癌細(xì)胞系中的PI3K/Akt 和MAPK/ERK 信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯并激活半胱天冬酶細(xì)胞凋亡途徑［14］；荔枝種子提取物以劑量依賴方式抑制前列腺癌細(xì)胞系的細(xì)胞活力和克隆生長，通過失活蛋白激酶B 信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期G1/S 期停滯，同時通過逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的表型抑制細(xì)胞遷移和侵襲［15］；黃芩提取物抑制前列腺癌細(xì)胞系增殖，顯著抑制裸鼠移植瘤生長［16］。五味子甲素是從五味子中提取物的一種木脂素類化合物，具有護肝、抗炎、抗凝血、防護腎損傷、抗抑郁、抑制胃腸平滑肌收縮及抗腫瘤等作用［4］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)五味子甲素在多種癌癥中具有潛在抗癌作用［7-9］。本研究發(fā)現(xiàn)，五味子甲素作用前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3 細(xì)胞的IC50為15.74 μmol/L，五味子甲素以劑量和時間依賴方式抑制PC-3 細(xì)胞增殖，同時以劑量依賴方式抑制細(xì)胞遷移及侵襲，這些提示五味子甲素具有良好的抗前列腺癌活性，具有開發(fā)成新型抗腫瘤藥物的潛在價值。

miRNAs 被證實在人類很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，如直腸癌、肝癌、肺癌和乳腺癌等［10］。研究報道，五味子葉素的抗癌作用與miRNAs 的調(diào)控密切相關(guān)。五味子甲素通過下調(diào)miR-155 的表達，導(dǎo)致PI3K/AKT 和Wnt/β-catenin信號通路失活，從而抑制乳腺癌細(xì)胞系增殖和遷移［9］。五味子甲素通過上調(diào)miR-195 的表達，抑制PI3K/AKT 和NF-κB 信號通路，從而增強結(jié)腸癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的化療敏感性［8］。此外，五味子甲素通過下調(diào)miR-429 使Wnt/β-catenin 和MEK/ERK信號通路失活，從而抑制甲狀腺癌細(xì)胞系的增殖、遷移及侵襲［7］。miR-505-3p已經(jīng)被證實與多種疾病密切相關(guān)，包括原發(fā)性膽汁性肝硬化，帕金森氏病、炎癥性腸病、胰腺癌、膠質(zhì)瘤和乳腺癌等［17-19］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-505-3p 在伴骨轉(zhuǎn)移的PCa組織中低表達，過表達miR-505-3p 能夠抑制PCa細(xì)胞的侵襲和遷移能力［13］。但五味子甲素是否能通過上調(diào)miR-505-3p 的表達，從而抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，目前未見文獻報道。本研究用不同濃度的五味子甲素處理前列腺癌PC-3 細(xì)胞48 h 后，發(fā)現(xiàn)五味子甲素以劑量依賴方式上調(diào)PC-3細(xì)胞中miR-505-3p的表達。此外，本研究用五味子甲素（15 μmol/L）處理miR-505-3p inhibitor 轉(zhuǎn)染的PC-3 細(xì)胞，CCK-8 及Transwell 實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-505-3p inhibitor 轉(zhuǎn)染后PC-3 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力均增強，而miR-505-3p inhibitor 能夠逆轉(zhuǎn)五味子甲素對PC-3 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。因此，筆者認(rèn)為五味子甲素通過上調(diào)miR-505-3p的表達，從而抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3細(xì)胞增殖、遷移及侵襲。

轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming growth factor-β，TGF-β）信號通路參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、遷移、粘附、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、衰老和凋亡，在胚胎發(fā)育、免疫反應(yīng)、傷口愈合和腫瘤進展等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用［20-21］。TGF-β信號通路在腫瘤進展中具有雙重調(diào)控作用。在腫瘤生長早期，TGF-β信號通路抑制細(xì)胞增殖，并促進細(xì)胞凋亡；在腫瘤生長晚期，TGF-β信號通路通過促進血管生成、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和免疫逃逸來誘導(dǎo)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［22-23］。研究表明，TGF-β通過誘導(dǎo)EMT 或促進癌細(xì)胞的侵襲性而成為PCa 骨轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素［24-25］，靶向TGF-β的療法可有效減少腫瘤細(xì)胞的骨轉(zhuǎn)移［26］。因此，靶向TGF-β信號通路似乎是抑制PCa 骨轉(zhuǎn)移的理想靶標(biāo)。本研究采用不同濃度的五味子甲素PC-3 細(xì)胞48 h 后，qRT-PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，五味子甲素以劑量依賴方式抑制PC-3 細(xì)胞中SMAD2、SMAD3 以及TGF-β信號傳導(dǎo)的下游靶基因（包括IL-11，PTHRP 和CTGF）的mRNA 表達。Western blot 結(jié)果進一步證實，五味子甲素處理的PC-3 細(xì)胞細(xì)胞核中SMAD2/3 蛋白表達無顯著差異，而細(xì)胞核中pSMAD2/3 蛋白表達顯著降低。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-505-3p 通過靶向SMAD2 和SMAD3 抑制TGF-β信號通路的激活，從而抑制PCa細(xì)胞的侵襲和遷移［13］。本研究通過構(gòu)建裸鼠移植瘤模型證實，五味子甲素顯著抑制PC-3 細(xì)胞裸鼠移植瘤生長；五味子甲素上調(diào)腫瘤組織中miR-505-3p 的表達水平，同時抑制腫瘤組織SMAD2 和SMAD3 蛋白的表達。因此，五味子甲素可能通過上調(diào)移植瘤組織中miR-505-3p 的表達，抑制TGFβ信號通路，從而抑制移植瘤的生長。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)五味子甲素可能是通過上調(diào)miR-505-3p 的表達，靶向下調(diào)SMAD2 和SMAD3 來抑制TGF-β通路激活，從而抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移PC-3 細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。