曲咪新乳膏的有關(guān)物質(zhì)研究

古麗霞，廖志剛，鄧紅，2，林華慶，梁勇坤，余良鐘，張蜀，2，賴昌威

（1.廣東藥科大學(xué)廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東廣州510006；2.廣東藥科大學(xué)廣東省局部精準(zhǔn)藥物遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006；3.廣東華潤順峰藥業(yè)有限公司，廣東佛山528300）

曲咪新乳膏為外用復(fù)方制劑，曾用名為皮康霜，每克乳膏中含有1 mg醋酸曲安奈德、10 mg硝酸咪康唑、3 000 U 硫酸新霉素；臨床上主要用于過敏性皮炎、濕疹、失禁相關(guān)性皮炎、體癬、股癬以及手足癬等病癥治療[1-4]。

曲咪新乳膏現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)有《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)》化學(xué)藥品地標(biāo)升國標(biāo)第二冊、1996 年版北京市藥品標(biāo)準(zhǔn)及企業(yè)內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)未對有關(guān)物質(zhì)作出要求，主要針對醋酸曲安奈德鑒別和含量測定作了規(guī)定：以氯化三苯四氮唑為顯色劑，紫外-可見光分光光度計測定其含量[5-6]。該方法穩(wěn)定性差，前處理繁瑣，檢測結(jié)果受環(huán)境影響，且無法測定主藥的有關(guān)物質(zhì)[7-8]。

目前，曲咪新乳膏質(zhì)量研究主要集中在3 種主藥的含量測定，已有文獻(xiàn)報道采用固相萃取-HPLC法、管碟法、HPLC-ELSE 法同時測定1 種或者2 種主藥含量[9-11]。梁秋霞等[12]簡述了曲咪新乳膏3種主藥的有關(guān)物質(zhì)和含量測定方法，其側(cè)重點在于對大量企業(yè)抽檢樣品進(jìn)行測定，評估市場上曲咪新乳膏總體質(zhì)量。本研究系統(tǒng)篩選了有關(guān)物質(zhì)供試品溶液的制備方法，通過強(qiáng)制降解試驗優(yōu)化了色譜條件，并探討曲咪新乳膏主藥的降解途徑，所建立的UHPLC-PDA 法和溶劑萃取-高速離心-HPLC-ELSE法能有效檢測出乳膏的有關(guān)物質(zhì)，為本品質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

AcQuity 超高效液相色譜儀（配制PDA 檢測器，美國Waters 公司）；2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；2420 型ELSD 檢測器（美國Waters 公司）；色譜柱為Thermo scientific AccucoreaQ C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；TGL-20B高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BSA224S-CW 分析天平、CP225D 分析天平（德國賽多利斯公司）。

曲咪新乳膏（廣東華潤順峰藥業(yè)有限公司，批號：20151111、20151112、20151113、20160601、20160602、20160603、20161201、20161202、20161203、20170301、20170302、20170303、20170601、20170602、20170603、20170808、20170810、20170812、20171201、20171202、20171203；A 企業(yè)，批號：160203、170403；B 企業(yè)，批號：B1058；C 企業(yè)，批號：170304；D 企業(yè)，批號：20170908；E 企業(yè)，批號：170904）；原料藥：醋酸曲安奈德（天津天藥藥業(yè)股份有限公司，批號：NTAC170701；質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.5%），硝酸咪康唑（廣州市漢普醫(yī)藥有限公司，批號：20170301；質(zhì)量分?jǐn)?shù)：100.5%），硫酸新霉素（宜昌三峽制藥有限公司，批號：201708034，每1 mg 的效價為667 個單位，水分：4.5%）；對照品：曲安奈德（批號：100055-201103，質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98.8%），新霉胺（批號：130411-200908）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈、四氫呋喃為色譜純；其他試劑為分析純；水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 曲安奈德及其他有關(guān)物質(zhì)

2.1.1 溶液配制 供試品溶液：取本品約2.5 g（約相當(dāng)于醋酸曲安奈德2.5 mg、硝酸咪康25 mg），精密稱定，置10 mL 量瓶中，加入甲醇-四氫呋喃（體積比1∶1，下同）適量，在80 ℃水浴分散2 min，放冷至室溫，加甲醇-四氫呋喃稀釋至刻度，輕搖勻，冰浴2 h，取出迅速經(jīng)微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

對照品溶液：取曲安奈德對照品約12.5 mg，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加甲醇-四氫呋喃振搖溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取該溶液與供試品溶液各l mL，置同一100 mL 量瓶中，用甲醇-四氫呋喃稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性 AcQuity 超高效液相色譜儀（配制PDA檢測器，美國Waters公司）；色譜柱為Thermo scientific AccucoreaQ C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動相A 為甲醇-乙腈-1%乙酸銨（體積比23∶23∶54），流動相B 為甲醇-乙腈-1%乙酸銨（體積比40∶40∶20），采用梯度洗脫（0～8 min，100%A；8～16 min，100%A→0%A；16～26 min，0%A；26～28 min，0%A→100%A）；流速：0.5 mL/min；檢測波長：235 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。取“2.1.1”項供試品溶液與對照品溶液依法進(jìn)樣，記錄色譜圖見圖1，可見曲安奈德峰與醋酸曲安奈德峰的分離度應(yīng)大于10.0。

圖1 醋酸曲安奈德、硝酸咪康唑?qū)φ掌啡芤海ˋ）與供試品溶液（B）色譜圖Figure 1 Chromatograms of triamcinolone acetonide acetate,miconazole nitratesystem control solution (A) and test solution(B)

2.1.3 強(qiáng)制降解實驗 取曲咪新乳膏（順峰，批號：20170808；A 企業(yè)，批號：160203）、缺醋酸曲安奈德陰性乳膏（自制）、缺硝酸咪康唑陰性乳膏（自制）、全空白乳膏各2.5 g，醋酸曲安奈德原料藥2.5 mg，硝酸咪康唑原料藥25 mg分別置10 mL量瓶；按下列方法處理后，加甲醇-四氫呋喃適量，80 ℃水浴分散2 min，放冷，加混合溶劑稀釋至刻度，冰浴2 h，搖勻，濾過，即得。

（1）酸強(qiáng)制降解試驗：加6 mol/L HCl溶液1 mL，放置10 h，加6 mol/L NaOH溶液1 mL。

（2）堿強(qiáng)制降解試驗：加6 mol/L NaOH 溶液1 mL，放置30 min，加6 mol/L HCl溶液1 mL。

（3）氧化強(qiáng)制降解試驗：加30%H2O2溶液1 mL，放置72 h。

（4）高溫強(qiáng)制降解試驗：烘箱110 ℃放置24 h，放至室溫。

（5）光照強(qiáng)制降解試驗：采用光照試驗儀（4 500 lx）照144 h。

分別取上述未破壞和各強(qiáng)制降解后溶液，按“2.1.2”項色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。

可見，曲咪新乳膏降解前可檢測出有關(guān)物質(zhì)曲安奈德；各降解條件下，較明顯的降解產(chǎn)物均為曲安奈德。乳膏在堿性條件下較不穩(wěn)定，除曲安奈德外，同時產(chǎn)生1 個醋酸曲安奈德降解產(chǎn)物（峰2）和1個硝酸咪康唑降解產(chǎn)物（峰4）；氧化降解陰性乳膏（自制）和供試品乳膏均檢測出峰13，推測為輔料降解產(chǎn)物。各主藥與降解產(chǎn)物峰歸屬見表1。

圖2 醋酸曲安奈德和硝酸咪康唑樣品溶液強(qiáng)制降解試驗色譜圖Figure 2 Forced degradation test chromatograms of sample solutions of triamcinolone acetonide acetate and miconazole nitrate

表1 主藥與降解產(chǎn)物峰歸屬Table 1 Peak assignment of main drug and degradation products

2.1.4 溶液穩(wěn)定性 取“2.1.1”項供試品溶液和對照品溶液，于室溫自然光下放置0、1、2、4、6、8 h 后取出，進(jìn)樣測定，供試品溶液可檢出曲安奈德，峰面積RSD 為2.16%，未見新雜質(zhì)產(chǎn)生；對照品溶液曲安奈德、醋酸曲安奈德、硝酸咪康唑峰面積RSD 為2.34%、2.87%、3.39%，表明供試品溶液和對照品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 檢測限 取“2.1.1”項對照品溶液，逐級稀釋，進(jìn)樣測定，按信噪比為3∶1計算檢測限，曲安奈德的檢測限為0.24 μg/mL、醋酸曲安奈德為0.42 μg/mL、硝酸咪康唑為3.54 μg/mL。

2.1.6 有關(guān)物質(zhì)樣品測定 取本品，依法測定，記錄色譜圖，結(jié)果曲安奈德為最大單個雜質(zhì)，按外標(biāo)法以峰面積計算均不超過1.0%；樣品中歸屬硝酸咪康唑的相關(guān)雜質(zhì)，均未超過對照溶液主峰面積0.5%；總雜質(zhì)均不超過對照溶液主峰面積1.5%。

2.2 硫酸新霉素有關(guān)物質(zhì)新霉胺

2.2.1 溶液配制 供試品溶液：取本品適量（約相當(dāng)于硫酸新霉素7.5 mg），精密稱定，置25 mL 離心管中，加入三氯甲烷0.5 mL，強(qiáng)力振搖使溶解，離心30 min（10 000 r/min），分取水層置于5 mL量瓶中；再加水約1 mL 于離心管，振搖萃取，離心30 min（10 000 r/min），分取水層，重復(fù)以上操作3 次，合并水層于5 mL 量瓶，用水稀釋至刻度，即得供試品溶液（每1 mL溶液含新霉素1.5 mg）。

新霉胺對照品溶液：取新霉胺對照品約15 mg，精密稱定，置50 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，作為新霉胺對照品儲備液（0.3 mg/mL）。精密量取上述對照品儲備液1 mL，置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，作為新霉胺對照品溶液（30 μg/mL）。

系統(tǒng)適用性溶液：取硫酸新霉素原料藥適量（約相當(dāng)于新霉素15 mg），精密稱定，置10 mL 量瓶中，再精密加入上述對照品儲備液1 mL，加水稀釋至刻度，配制硫酸新霉素和新霉胺混合對照品溶液作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性 2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司），2420 型ELSD 檢測器（美國Waters 公司）；色譜柱為Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-含0.7%五氟丙酸的20 mmol/L 乙酸銨溶液（體積比55∶45）；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；霧化溫度：60 ℃；漂移管溫度：70 ℃；載氣壓力：206.85 kPa；撞擊器：關(guān)；增益值：10。取“2.2.1”項混合對照品溶液，依法進(jìn)樣，記錄色譜圖見圖3，可見新霉素峰保留時間約為8 min。

圖3 新霉素系統(tǒng)適用性溶液（A）與供試品溶液（B）色譜圖Figure 3 Chromatograms of neomycin system suitability solution(A)and sample solution(B)

2.2.3 強(qiáng)制降解試驗 取曲咪新乳膏（順峰，批號：20170812；A 企業(yè)，批號：170403）、缺硫酸新霉素陰性乳膏（自制）、全空白乳膏各2 g，硫酸新霉素原料藥7.5 mg，分別置25 mL 離心管，加入0.5 mL 三氯甲烷，振搖使溶解，按下列方法處理。

（1）酸強(qiáng)制降解試驗：加入2 mol/L HCl 溶液1 mL，超聲振搖1 h，放置過夜，加入1 mL 2 mol/L NaOH 溶液，加水約1 mL，振搖，離心30 min（10 000 r/min），取水層于5 mL量瓶并稀釋至刻度。

（2）堿強(qiáng)制降解試驗：加入2 mol/L NaOH 溶液1 mL，超聲振搖1 h，加入1 mL 2 mol/L HCl 溶液，加水約1 mL，振搖，離心30 min（10 000 r/min），取水層于5 mL量瓶并稀釋至刻度。

（3）氧化強(qiáng)制降解試驗：加入三氯甲烷0.5 mL，振搖使溶解，加入1 mL 30% H2O2溶液，超聲振搖1 h，按“2.2.1”項供試品溶液自“加水約1 mL…”制備。

（4）高溫強(qiáng)制降解試驗：加入三氯甲烷0.5 mL，振搖使溶解，沸水浴1 h，放冷并補(bǔ)足失重，按“2.2.1”項供試品溶液自“加水約1 mL…”制備。

（5）光照強(qiáng)制降解試驗：加入三氯甲烷0.5 mL，置光照試驗儀（4 500 lx）于2 h，放冷并補(bǔ)足失重，按“2.2.1”項供試品溶液自“加水約1 mL…”制備。

分別取上述未破壞和各強(qiáng)制降解后溶液，按“2.2.2”項色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，結(jié)果見圖4?？梢?，曲咪新乳膏降解前新霉胺均符合限量要求；各降解途徑新霉胺均無明顯增加。

2.2.4 加標(biāo)回收率 精密稱取曲咪新乳膏（批號：20170810）約2.5 g 于25 mL 離心管中，加入“2.2.1”項下的新霉胺對照溶液0.5 mL，自加入“三氯甲烷0.5 mL”起，按“2.2.1”項供試品溶液的制備方法制備加標(biāo)樣品（6份），計算加標(biāo)樣品的回收率為100.9%，RSD為1.99%。

2.2.5 溶液穩(wěn)定性 由于供試品未檢出新霉胺，故采用加標(biāo)樣品進(jìn)行溶液穩(wěn)定性試驗：取“2.2.4”項下的一份加標(biāo)樣品，室溫放置，于0、1、2、4、6、8 h 測定，記錄新霉胺的峰面積，計算RSD 為3.43%，表明溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.6 檢測限 精密稱取新霉胺對照品適量，逐級稀釋，進(jìn)樣測定，按信噪比為3∶1 計算檢測限，新霉胺檢測限為6 μg/mL，即在供試品溶液濃度為1.5 mg/mL，含0.4%的新霉胺即被檢出，滿足ChP2020 硫酸新霉素中新霉胺的限度為2.0%的要求。

2.2.7 有關(guān)物質(zhì)樣品測定 按“2.2.2”項下色譜條件，注入色譜儀，記錄色譜圖，代表性圖譜見圖3，結(jié)果均無檢出新霉胺。

3 討論

3.1 曲安奈德及其他有關(guān)物質(zhì)

3.1.1 供試品溶液制備溶劑和方法的考察 醋酸曲安奈德在三氯甲烷中溶解，硝酸咪康唑略溶于甲醇。根據(jù)乳膏和主藥的溶解性，參考文獻(xiàn)[13-15]，本研究對甲醇、異丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、四氫呋喃及其兩兩組合進(jìn)行篩選，結(jié)果顯示三氯甲烷-甲醇（體積比1∶9）和甲醇-四氫呋喃（體積比1∶1）可分散曲咪新乳膏且容易濾過，使用其他溶劑出現(xiàn)渾濁或者分層，或無法過濾；進(jìn)一步比較2 種混合溶劑，結(jié)果顯示甲醇-四氫呋喃（體積比1∶1）溶解快且完全，因此選擇甲醇-四氫呋喃（體積比1∶1）作為乳膏中醋酸曲安奈德和硝酸咪康唑的有關(guān)物質(zhì)測定供試品溶液制備的溶劑。參考2020 年版《中國藥典》（ChP2020）中醋酸曲安奈德乳膏含量測定項下供試品溶液的制備方法“置80 ℃水浴中加熱2 min”，考察了醋酸曲安奈德和硝酸咪康唑的回收率分別為99.87%、102.09%，且未產(chǎn)生明顯降解產(chǎn)物，說明80 ℃水浴不影響有關(guān)物質(zhì)測定。

圖4 硫酸新霉素樣品溶液強(qiáng)制降解試驗液相色譜圖Figure 4 Forced degradation test chromatograms of neomycin sulfate sample solutions

3.1.2 色譜條件的選擇 參考文獻(xiàn)及各國藥典，醋酸曲安奈德的流動相系統(tǒng)均采用甲醇-水或乙腈-水；硝酸咪康唑的流動相系統(tǒng)均采用甲醇-乙腈-乙酸銨[16]。經(jīng)試驗，甲醇-水或乙腈-水系統(tǒng)（不加乙酸銨）硝酸咪康唑無法出峰，因此，擬采用甲醇-乙腈-乙酸銨系統(tǒng)，同時測定乳膏中醋酸曲安奈德和硝酸咪康唑的有關(guān)物質(zhì)。

ChP2020 中醋酸曲安奈德檢測波長為240 nm，硝酸咪康唑為230 nm，BP2018咪康唑乳膏為235 nm，USP42～NF37 硝酸咪康唑乳膏為225 nm[17-19]。采用二極管陣列檢測器進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)波長為235 nm 時基線較平穩(wěn)，可同時檢測230 nm（硝酸咪康唑）和240 nm（醋酸曲安奈德）的有關(guān)物質(zhì)，并可在兩者之間獲得相對平衡的響應(yīng)值，因此選擇檢測波長為235 nm。

3.1.3 強(qiáng)制降解試驗 本研究曾選擇較溫和的條件進(jìn)行破壞，本品穩(wěn)定，逐步加劇破壞條件至有明顯的降解產(chǎn)物。強(qiáng)制降解試驗顯示，乳膏在堿性條件下較不穩(wěn)定，加堿30 min 即需終止試驗，并產(chǎn)生較多降解產(chǎn)物。高溫強(qiáng)制降解試驗曾嘗試加入溶劑甲醇-四氫呋喃，沸水浴加熱破壞，結(jié)果溶劑很快揮干，且乳膏制劑經(jīng)處理后無法濾過；后采用將樣品直接放入烘箱110 ℃、24 h，結(jié)果原料藥穩(wěn)定，制劑中曲安奈德峰增大，其中缺硝酸咪康唑陰性乳膏醋酸曲安奈德幾乎完全降解為曲安奈德。原因可能是乳膏為半固體制劑，原料藥為固體，固體狀態(tài)下物質(zhì)較為穩(wěn)定。成品制劑比抽離硝酸咪康唑陰性乳膏穩(wěn)定，說明處方工藝的合理性。

3.1.4 有關(guān)物質(zhì)限度 ChP2020 中醋酸曲安奈德原料藥曲安奈德的限量為1.0%，總雜質(zhì)限度為2.5%；硝酸咪康唑原料藥總雜質(zhì)限度為0.5%。經(jīng)強(qiáng)制降解試驗和對多批樣品的檢測，本品主要降解產(chǎn)物為曲安奈德，暫定本品曲安奈德的限量為1.0%，其他最大單個雜質(zhì)不得超過1.0%，總雜質(zhì)不得超過3.0%。由于乳膏處方使用了較多輔料，且采用了梯度洗脫的色譜條件，有關(guān)物質(zhì)的檢查和計算需排除輔料峰和溶劑峰。

3.2 硫酸新霉素有關(guān)物質(zhì)新霉胺

3.2.1 供試品溶液制備方法的考察 乳膏屬半固體制劑，分油水兩相，前期研究直接加水超聲或加入溫水后溫水浴，體系呈乳濁狀，無法過濾，因此先加入三氯甲烷強(qiáng)力振搖使油、水相分離，后以水洗滌油相使提取完全，硫酸新霉素在水中極易溶解，離心分離后合并水層為供試品溶液。

3.2.2 色譜條件的選擇 各國藥典中硫酸新霉素主要采用薄層色譜法檢查新霉胺的限量。本研究曾參考ChP2020、BP2018[18]和李曉鑫[20]的薄層色譜條件進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示供試品溶液斑點過載明顯，新霉胺斑點顯色時容易化開，重現(xiàn)性差。參考戴向東[21]HPLC-ELSE 法，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化色譜條件，發(fā)現(xiàn)乙酸銨降至20 mmol/L 時，新霉素的保留時間略增加；五氟丙酸降至0.7%時，新霉素的保留時間不變，優(yōu)化后的色譜條件離子對試劑和緩沖鹽用量更少。

3.2.3 強(qiáng)制降解條件的選擇 新霉素在酸、堿和高溫試驗中均明顯降解，但新霉胺仍未超過限度，說明新霉胺并非其主要降解產(chǎn)物，在原料藥控制限度即可。新霉素主要成分為新霉素A（新霉胺）、新霉素B、新霉素C，其中新霉素C 效價約為新霉素B 的二分之一，因此EP9.0 和BP2018 中還規(guī)定了新霉素C 峰面積應(yīng)為新霉素B 的3%～15%[22]；查閱資料可知新霉素還含有巴龍霉胺、巴龍霉素Ⅰ和Ⅱ、新霉素的單-N-乙?；苌铮╪eomycin LP-A、LP-B 和LP-C）等有關(guān)物質(zhì)[23-24]，有待進(jìn)一步研究。

4 總結(jié)

本研究收集了市售5個其他企業(yè)生產(chǎn)的曲咪新乳膏，從性狀、離心穩(wěn)定性及有關(guān)物質(zhì)3 個方面比較，選擇了質(zhì)量最優(yōu)的A 企業(yè)產(chǎn)品作為對照藥品同時進(jìn)行強(qiáng)制降解試驗，建立了UHPLC-PDA 法和高速離心-HPLC-ELSE 法測定曲咪新乳膏的有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果表明方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，可有效分離曲咪新乳膏3 種主藥的有關(guān)物質(zhì)，為本品質(zhì)量控制提供參考。