基于GC-MS 指紋圖譜技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析鑒別不同產(chǎn)地白術(shù)的研究

李然，李靜，徐長瓊，唐奇，夏麗瓊，黃妍君，李旭富，黎春輝，童巧珍,5

（1.岳陽市婦幼保健院科研所，湖南岳陽414000；2.岳陽市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，湖南岳陽414000；3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州510006；4.北京同仁堂平江白術(shù)有限公司，湖南岳陽414000；5.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南長沙410208）

白術(shù)藥材為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖，是常用的大宗中藥材，又名“于術(shù)”“冬術(shù)”“浙術(shù)”，白術(shù)主產(chǎn)于浙江、湖南、安徽、江西、湖北、四川等地，具有健脾益氣、燥濕利水、安胎等功效[1]。白術(shù)的化學(xué)成分主要有揮發(fā)油、內(nèi)酯類、多糖類、苷類、氨基酸等成分[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，白術(shù)具有抗腫瘤、抗感染、調(diào)節(jié)胃腸功能、抗抑郁、抗老年癡呆等藥理活性，其中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和多糖成分具抗腫瘤與抗感染作用，白術(shù)揮發(fā)油具有調(diào)節(jié)胃腸、抗抑郁[3-4]、抗癌[5]、修復(fù)胃黏膜[6]、抑菌[7]等作用。不同產(chǎn)地因其生境的不同，產(chǎn)出藥材所含化學(xué)成分各有差異。已有文獻(xiàn)報(bào)道基于UPLC-Q-TOF-MS/MS 分析了浙江、河北、河南、江西等地產(chǎn)白術(shù)化學(xué)成分的差異[8]，以上方法檢出成分多為非揮發(fā)性成分，而通過GC-MS 對不同產(chǎn)地白術(shù)具多重藥效的揮發(fā)油進(jìn)行差異性成分鑒定與分析的研究卻鮮有報(bào)道。

本文運(yùn)用水蒸氣蒸餾法提取了湖南、安徽、浙江3 個不同產(chǎn)區(qū)內(nèi)所產(chǎn)白術(shù)的揮發(fā)油，進(jìn)行GC-MS分析，通過主成分分析、偏最小二乘判別分析、正交偏最小二乘判別分析尋找差異性化學(xué)成分，并運(yùn)用NIST 普庫檢索與文獻(xiàn)查對鑒定差異性化學(xué)成分，為不同產(chǎn)地白術(shù)的鑒別與質(zhì)量評價(jià)提供一定參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

BSA224S-CW 型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；DFT-200 型手提式高速萬能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；98-I-B 型電子調(diào)溫電熱套（天津泰斯特儀器有限公司）；揮發(fā)油提取器；7890B-5977A 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫公司）；無水硫酸鈉（廣東光華科技股份有限公司，批號：20171120）。

1.2 藥物

18 批白術(shù)樣品分別收集自湖南、安徽與浙江，樣品由湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院童巧珍教授鑒定為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖，具體來源情況見表1。

表1 樣品來源信息表Table 1 Sample source information

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

取各白術(shù)供試品各100 g，用粉碎機(jī)粉碎，過二號篩。置1 000 mL 圓底燒瓶中，加水500 mL，浸泡5 h，參照2020 年版《中國藥典》“揮發(fā)油測定法”提取，所得揮發(fā)油加入適量無水硫酸鈉充分脫水，分別取各供試品揮發(fā)油20 μL，置2 mL棕色量瓶中，加正己烷至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.2 測定條件

色譜條件：色譜柱為HP-5 MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）毛細(xì)管柱，進(jìn)樣量為0.1 μL；分流比為30∶1；氣化室溫度為250 ℃；載氣為高純度He（99.999%）。程序升溫如下：初始柱溫為100 ℃，然后以速率3 ℃/min 升至130 ℃，保留10 min，再以速率6 ℃/min升至250 ℃。

質(zhì)譜條件：EI 離子源；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；接口溫度為280 ℃；電離能量為70 eV；EM 電壓2 165 V；溶劑延遲3 min；掃描質(zhì)量范圍m/z40～550。

2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

將各白術(shù)供試品原始色譜圖在GC-MS 數(shù)據(jù)處理工作站積分后進(jìn)行提取，用中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)的數(shù)據(jù)格式模板進(jìn)行預(yù)處理，導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)，以蒼術(shù)酮色譜峰進(jìn)行保留時(shí)間的校正，進(jìn)行峰匹配等，得白術(shù)樣品各保留時(shí)間下色譜峰的匹配結(jié)果，將結(jié)果整理成二維數(shù)據(jù)矩陣，包含各樣品的保留時(shí)間和峰強(qiáng)度等信息。將整理好的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P 14 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，首先進(jìn)行PCA 分析，以便直觀分析不同產(chǎn)地白術(shù)的分類情況；然后進(jìn)一步采用PLS-DA 與OPLSDA 分析對不同產(chǎn)地白術(shù)樣品進(jìn)行分類，其中判別模型質(zhì)量好壞的參數(shù)為R2Y（該值為模型的解釋率）以及Q2（模型的預(yù)測能力），R2Y 越接近1，說明模型越穩(wěn)定，Q2＞0.5 說明模型的預(yù)測率較高。根據(jù)OPLS-DA 模型的常用變量載荷評價(jià)參數(shù)VIP（VIP＞1），并結(jié)合t-test 的P值（P＜0.05）來尋找差異性成分，再運(yùn)用NIST 普庫檢索與文獻(xiàn)查對鑒定差異性化學(xué)成分。

3 結(jié)果

3.1 總離子流圖的比較

對不同產(chǎn)地白術(shù)揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS 分析，總離子流圖見圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各產(chǎn)地白術(shù)樣品揮發(fā)油的GC-MS 總離子流圖基本相似，經(jīng)積分并運(yùn)用峰面積歸一化法計(jì)算各色譜峰的相對峰面積，發(fā)現(xiàn)部分不同產(chǎn)地相同保留時(shí)間下色譜峰的相對峰面積有一定差異，說明不同產(chǎn)地白術(shù)揮發(fā)性成分相似，但含量存在一定差異。

3.2 PCA 分析

從各產(chǎn)區(qū)白術(shù)揮發(fā)油的GC-MS 圖譜來看，其揮發(fā)油成分具有一定的相似性，難以用常規(guī)數(shù)據(jù)分析方法進(jìn)行區(qū)分。PCA 是多變量識別模式的方法，是一種無監(jiān)督的多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)，可在損失較少數(shù)據(jù)的前提下利用少量的主成分解釋大量變量之間的相關(guān)性，進(jìn)而有效地把多維原始數(shù)據(jù)降維。將18 個白術(shù)樣品的匹配數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMMA-P 14.1 中，進(jìn)行PCA 分析，PCA 得分圖見圖2（a），R2X=0.686，Q2=0.342。從圖2（a）可看出，不同產(chǎn)地白術(shù)樣品間未能完全區(qū)分，在95%的置信區(qū)間內(nèi)，S1 出現(xiàn)了異常，除湖南產(chǎn)區(qū)部分白術(shù)樣品（S2、S4）未能與浙江與安徽白術(shù)樣品完全區(qū)分外，安徽與浙江產(chǎn)區(qū)白術(shù)均可被明顯區(qū)分，說明在GC-MS 數(shù)據(jù)中存在與產(chǎn)地相關(guān)的變量。進(jìn)一步運(yùn)用Hotelling T2 檢驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了18 個樣本的數(shù)據(jù)，結(jié)果無異常值，見圖2（b）。

3.3 PLS-DA分析

圖1 不同產(chǎn)地白術(shù)揮發(fā)油的GC-MS總離子流圖Figure 1 GC-MS total ion current diagrams of Volatile oil from Atractylodes macrocephala Koidz in different origins

圖2 PCA得分圖（a）與Hotelling T2 檢驗(yàn)圖（b）Figure 2 The PCA score graph(a)and Hotelling T2 test graph(b)

PCA 是一種無監(jiān)督的分析方法，在確定差異成分時(shí)，無法忽略組內(nèi)差異與隨機(jī)誤差，所以進(jìn)一步采用PLS-DA 分析方法，該方法為一種有監(jiān)督模式識別的方法，可用于確定不同產(chǎn)地白術(shù)的差異化學(xué)成分。圖3（a）為不同產(chǎn)地白術(shù)PLS-DA 得分散點(diǎn)圖，R2X=0.73，R2Y=0.93，Q2=0.719?？梢?，3 個產(chǎn)地的白術(shù)樣品被明顯區(qū)分，表明不同產(chǎn)地白術(shù)揮發(fā)性化學(xué)成分有明顯差異。

排列實(shí)驗(yàn)是一種外部模型驗(yàn)證方法，主要用于驗(yàn)證PLS-DA 的擬合程度，通過排列試驗(yàn)隨機(jī)進(jìn)行200 次改變分類變量y 的排列順序得到相應(yīng)不同的隨機(jī)排列，結(jié)果見圖3（b）?？梢?，PLS-DA 模型排列試驗(yàn)中左端隨機(jī)排列產(chǎn)生的R2和Q2值均小于右端的原始值，表明模型的預(yù)測能力大于隨機(jī)排列y 的預(yù)測能力，表示模型有效，可以進(jìn)行后續(xù)的差異性分析[9]。

圖3 PLS-DA得分圖（a）和200個排列模型驗(yàn)證圖（b）Figure 3 The PLS-DA obtained scatter plot(a)and 200 arrangement model verification plot(b)

3.4 OPLS-DA分析

進(jìn)一步對處理后的GC-MS 數(shù)據(jù)建立OPLS-DA模型，研究不同產(chǎn)地白術(shù)揮發(fā)油的差異性并篩選特征差異指標(biāo)性成分。有監(jiān)督的OPLS-DA 是一種標(biāo)準(zhǔn)的高維數(shù)據(jù)分析方法，通過建立預(yù)測集和響應(yīng)集的線性關(guān)系對樣本進(jìn)行分類，進(jìn)而提取樣本的特征性差異信息。進(jìn)行OPLS-DA 分析時(shí)，由于預(yù)測變量常遠(yuǎn)大于樣本量，容易導(dǎo)致建立的模型發(fā)生過度擬合且高估其預(yù)測能力，因此需要運(yùn)用交叉驗(yàn)證判斷OPLS-DA 模型效果。驗(yàn)證結(jié)果中R2代表模型的擬合度，Q2代表模型的預(yù)測能力，R2越接近1，表明模型描述的數(shù)據(jù)越完整；Q2越接近1，表明模型的預(yù)測能力越高。

將處理好的GC-MS 數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMMA-P 14.1 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件中，建立OPLS-DA 模型，結(jié)果顯示建立的模型中，當(dāng)A與B比較時(shí)，R2X=0.982、R2Y=1、Q2=0.887；當(dāng)A 與C 比較時(shí)，R2X=0.862、R2Y=0.999、Q2=0.952；當(dāng)B 與C 比較時(shí)，R2X=0.867、R2Y=0.999、Q2=0.974；表明模型可以描述大部分的GC-MS數(shù)據(jù)，并且具有良好的預(yù)測能力。OPLS-DA 得分圖散點(diǎn)圖見圖4（a、c、e），可見各產(chǎn)區(qū)白術(shù)樣本均可以很好地被區(qū)分，表明白術(shù)揮發(fā)油成分在同一產(chǎn)區(qū)中具有一定相似性，而不同產(chǎn)區(qū)樣本之間存在一定差異。進(jìn)一步運(yùn)用置換檢驗(yàn)評價(jià)模型的有效性，進(jìn)行200次置換檢驗(yàn)，結(jié)果見圖4（b、d、f），所有置換檢驗(yàn)的R2和Q2均小于所建立模型的原始值，并且Q2的回歸線在Y 軸上的截距為負(fù)值，表明所建立的模型沒有出現(xiàn)過度擬合，預(yù)測能力良好，可以進(jìn)行后續(xù)的差異性分析。

通過色譜峰積分、匹配等，從3 個產(chǎn)地白術(shù)供試品揮發(fā)油檢測結(jié)果中共提取了68個成分，各化合物分別編號1～68。為了研究對區(qū)分3個產(chǎn)區(qū)樣本貢獻(xiàn)最大的差異性化學(xué)成分，運(yùn)用OPLS-DA 中的SPlot進(jìn)行分析，距離中心區(qū)域越遠(yuǎn)，代表該成分就是組間分離貢獻(xiàn)越大的成分。湖南（A）與安徽（B）、湖南（A）與浙江（C）、安徽（B）與浙江（C）白術(shù)的S-Plot分析圖見圖5（a、c、e）。運(yùn)用VIP 值描述差異變量的貢獻(xiàn)程度，當(dāng)VIP 值＞1，且經(jīng)t檢驗(yàn)P＜0.05 時(shí)，即認(rèn)為該成分為組間分離貢獻(xiàn)率較大的差異化學(xué)成分。湖南（A）與安徽（B）、湖南（A）與浙江（C）、安徽（B）與浙江（C）產(chǎn)白術(shù)間VIP 得分圖見圖5（b、d、f）。在湖南（A）與安徽（B）產(chǎn)白術(shù)揮發(fā)油中共找到19 個差異化學(xué)成分（表2），在湖南（A）與浙江（C）白術(shù)揮發(fā)油中共找到22 個差異化學(xué)成分（表3），在安徽（B）與浙江（C）白術(shù)揮發(fā)油中共找到25 個差異化學(xué)成分（表4）。

3.5 不同產(chǎn)地白術(shù)差異成分的鑒定

圖4 OIPLS-DA得分圖（a、c、e）和200次置換檢驗(yàn)?zāi)Ｐ万?yàn)證圖（b、d、f）Figure 4 The OIPLS-DA obtained scatter plots(a,c,e)and 200 permutation test model verification plots(b,d,f)

通過NIST 14 進(jìn)行匹配與結(jié)合文獻(xiàn)核查，分別鑒定3個產(chǎn)地兩兩之間差異性成分。結(jié)果表明：（1）湖南（A）與安徽（B）產(chǎn)白術(shù)揮發(fā)油中的差異成分為蒼術(shù)酮、β-欖香烯、（1aR）-1aβ,2,3,3a,4,5,6,7bβ-八氫-1,1,3aβ,7-四甲基-1H-環(huán)丙烷[a]柰、纈草稀醛-4,7(11)二烯等，其中平均相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1.00%的差異性成分有蒼術(shù)酮、桉油烯醇、3,5,11-洋三烯、巴倫西亞橘烯、β-瑟林烯、香附烯酮；產(chǎn)自安徽的白術(shù)含有相對較多的蒼術(shù)酮、（1aR）-1aβ,2,3,3a,4,5,6,7bβ-八氫-1,1,3aβ,7-四甲基-1H-環(huán)丙烷[a]萘；其余差異成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為湖南產(chǎn)的較安徽產(chǎn)的高。（2）湖南（A）與浙江（C）產(chǎn)白術(shù)揮發(fā)油中的差異成分有木香醇、(1aR)-1aβ,2,3,3a,4,5,6,7bβ-八氫-1,1,3aβ,7-四甲基-1H-環(huán)丙烷[a]柰、4(15),5,10(14)-大根香葉三烯-1-醇等，其中平均相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1.00%的差異性成分有β-瑟林烯、香附烯酮、1,5-環(huán)癸二烯、1,5-二甲基-8-(1-甲基亞乙基)-(E,E)-，蒼術(shù)酮則無差異；湖南（A）產(chǎn)白術(shù)含有相對較多的(-)-β-欖香烯、1,5-環(huán)癸二烯、1,5-二甲基-8-(1-甲基亞乙基)-(E,E)-、1,3,3-三甲基-2-(2-甲基-環(huán)丙基）-環(huán)己烯、莎草烯；其余差異成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為浙江產(chǎn)的較湖南產(chǎn)的高。（3）安徽（B）與浙江（C）產(chǎn)白術(shù)揮發(fā)油中的差異成分有環(huán)氧化蛇麻烯Ⅱ、4(15),5,10(14)-大根香葉三烯-1-醇、木香醇、(-)-欖香醇等，其中平均相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1.00%的差異性成分有巴倫西亞橘烯、β-瑟林烯、1,5-環(huán)癸二烯、1,5-二甲基-8-（1-甲基亞乙基）-(E,E)-、蒼術(shù)酮、(1S,2E,6E,10R)-3,7,11,11-四甲基雙環(huán)[8.1.0]十一烷-2,6-二烯。安徽（B）產(chǎn)白術(shù)含有相對較多的1,5-環(huán)癸二烯，1,5-二甲基-8-（1-甲基亞乙基）-,(E,E)-、蒼術(shù)酮、（(1S,2E,6E,10R)-3,7,11,11-四甲基雙環(huán)[8.1.0]十一烷-2,6-二烯；其余差異成分均為浙江產(chǎn)白術(shù)和相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。

圖5 不同產(chǎn)地白術(shù)揮發(fā)性成分的S-Plot得分圖（a、c、e）和VIP值條形圖（b、d、f）Figure 5 S-Plot score graphs(a,c,e)and VIP value bar graphs(b,d,f)of the volatile components of Atractylodes macrocephala Koidz.from different origins

4 討論

中藥的質(zhì)量與其產(chǎn)地密切相關(guān)，故尋找有效方法進(jìn)行產(chǎn)地鑒別，對藥材的質(zhì)量評價(jià)意義重大。對于揮發(fā)油含量較高且揮發(fā)油為其藥效的主要有效成分的品種，運(yùn)用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油、并運(yùn)用GC-MS 分析鑒定該不同產(chǎn)地藥材揮發(fā)油成分的差異，該操作簡單、快速、專屬性強(qiáng)，可有效用于中藥質(zhì)量控制。本研究運(yùn)用GC-MS 技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析對湖南、安徽、浙江產(chǎn)白術(shù)的揮發(fā)性化學(xué)成分的差異性進(jìn)行分析，通過色譜峰積分、匹配等共提取了68個成分，運(yùn)用PCA、PLS-DA 和OPLS-DA 方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對各產(chǎn)地間差異性化學(xué)成分進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，基于GC-MS 并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析的方法可有效對不同產(chǎn)地白術(shù)進(jìn)行準(zhǔn)確地分類與鑒別，其中有監(jiān)督的PLS-DA 與OPLS-DA 的分析結(jié)果優(yōu)于無監(jiān)督的PCA 分析，且在2 個產(chǎn)地間差異成分的分析與鑒別中，OPLS-DA的效果最優(yōu)。

化學(xué)成分差異性分析結(jié)果表明，在湖南與安徽產(chǎn)白術(shù)之間，安徽產(chǎn)的白術(shù)含有相對較多的蒼術(shù)酮、（1aR）-1aβ,2,3,3a,4,5,6,7bβ-八氫-1,1,3aβ,7-四甲基-1H-環(huán)丙烷[a]萘；在湖南與浙江產(chǎn)白術(shù)之間，《中國藥典》中白術(shù)的質(zhì)量指標(biāo)性成分蒼術(shù)酮則無差異，湖南產(chǎn)白術(shù)含有相對較多的(-)-β-欖香烯、1,5-環(huán)癸二烯、1,5-二甲基-8-(1-甲基亞乙基)-(E,E)-、1,3,3-三甲基-2-(2-甲基-環(huán)丙基）-環(huán)己烯、莎草烯；安徽與浙江產(chǎn)白術(shù)相比，安徽產(chǎn)白術(shù)含有相對較多的1,5-環(huán)癸二烯、1,5-二甲基-8-（1-甲基亞乙基）-(E,E)-、蒼術(shù)酮、（(1S,2E,6E,10R)-3,7,11,11-四甲基雙環(huán)[8.1.0]

十一烷-2,6-二烯。綜上可見，基于GC-MS 分析并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析的方法，可以對白術(shù)進(jìn)行很好的產(chǎn)地鑒別。

表2 湖南（A）與安徽（B）白術(shù)揮發(fā)油差異化學(xué)成分Table 2 The difference chemical compositions of volatile oil from Atractylodes macrocephala Koidz.Produced in Hunan(A)and Anhui(B) (P＜0.05,n=6）

表3 湖南（A）與浙江（C）白術(shù)揮發(fā)油差異化學(xué)成分Table 3 The difference chemical compositions of volatile oil from Atractylodes macrocephala Koidz.Produced in Hunan (A) and Zhejiang(C) (P＜0.05,n=6）

表4 安徽（B）與浙江（C）白術(shù)揮發(fā)油差異化學(xué)成分表Table 4 The difference chemical compositions of volatile oil from Atractylodes macrocephala Koidz.Produced in Anhui (B) and Zhejiang(C)(P＜0.05,n=6）