青紫顆粒制備工藝及質(zhì)量控制方法研究

馬葆睿，倪健，龐琳諾，蔡夢(mèng)如，覃柳瑩，白杰，張志勤，張萌，王曉玲，曲昌海

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京102488；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院，北京100045)

青紫顆粒以首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院院內(nèi)制劑青紫合劑為基礎(chǔ)，經(jīng)改劑型而成。該方在臨床已實(shí)踐多年，廣泛應(yīng)用于治療過(guò)敏性紫癜及其合并癥，療效確切[1]。青紫顆粒由青黛、紫草、茵陳、丹參等藥味組成，藥理試驗(yàn)研究表明青紫顆粒可有效改善因卵蛋白所致過(guò)敏性紫癜大鼠炎癥反應(yīng)和腎臟組織病理學(xué)損害[2]。青黛、紫草均有抗感染、鎮(zhèn)痛的作用[3-4]；丹參有活血、涼血消癰的作用，有研究表明其主要成分丹酚酸B對(duì)慢性血清病腎炎大鼠腎臟具有一定的保護(hù)作用[5]，茵陳具有清熱利濕、利膽退黃的作用，其中綠原酸具有良好的抗炎作用[6]。本研究建立青紫顆粒中丹酚酸B和綠原酸的含量測(cè)定方法，并將此方法用于青紫顆粒制備工藝過(guò)程的質(zhì)量控制，并對(duì)中試樣品中丹酚酸B 和綠原酸含量進(jìn)行測(cè)定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT 高效液相色譜儀、SPD-M20A 檢測(cè)器（日本島津公司）；SB-5200DTD 超聲波提取器（寧波新芝生物科技股份有限公司）；MS105DU 分析天平（0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；YP5002電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）。

1.2 藥品與試劑

青黛（生產(chǎn)批號(hào)：20180328）、紫草（生產(chǎn)批號(hào)：20180704）、茵陳（生產(chǎn)批號(hào)：20181020）、綿馬貫眾（生產(chǎn)批號(hào)：20171213）、丹參（生產(chǎn)批號(hào)：20181006）、白芷（生產(chǎn)批號(hào)：20180411）、北寒水石（生產(chǎn)批號(hào)：20180407）、威靈仙（生產(chǎn)批號(hào)：20180923），以上藥材均購(gòu)自北京本草方源藥業(yè)有限公司，經(jīng)北京本草方源藥物有限公司研究助理王穎鑒定為正品。丹酚酸B（批號(hào)111562-201917，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.6%）、綠原酸（批號(hào)110753-201817，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.8%）中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；3 批青紫顆粒（自制，批號(hào)201015、201016、201017）；甲醇、乙腈（色譜醇，F(xiàn)isher 公司）；純凈水（娃哈哈集團(tuán)有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測(cè)定丹酚酸B與綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相A，0.1%磷酸為流動(dòng)相B，梯度洗脫（0～25 min，7%A；25～26 min，7%A～21%A；26～55 min，21%A；55～56 min，21%A～7%A；56～75 min，7%A）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：286 nm（丹酚酸B）和327 nm（綠原酸）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取丹酚酸B 對(duì)照品及綠原酸對(duì)照品適量，精密稱定，置25 mL 棕色量瓶中，加75%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲醇制成每1 mL 含丹酚酸B 784.39 μg、綠原酸170.37 μg 的母液，取0.5 mL 母液置于10 mL棕色量瓶中，加75%甲醇至刻度，即得每1 mL 含丹酚酸B 39.22 μg、綠原酸8.52 μg 的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 顆粒供試品溶液：取顆粒適量，研成細(xì)粉，取約0.5 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min（300 W，40 kHz），放冷后稱定質(zhì)量，用75%甲醇溶液補(bǔ)重，濾過(guò)，制得顆粒供試品溶液。

提取液供試品溶液：取浸膏粉約1 g，精密稱定，置于50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min（300 W，40 kHz），放冷后稱定質(zhì)量，用75%甲醇溶液補(bǔ)足損失的質(zhì)量，濾過(guò)，制得浸膏粉供試品溶液。

2.1.4 陰性樣品溶液的制備 同法分別自制不含丹參及茵陳的陰性樣品，按照“2.1.3”項(xiàng)同法處理制得陰性供試品溶液。

2.1.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，結(jié)果顯示供試品溶液色譜圖中丹酚酸B 和綠原酸與對(duì)照品色譜峰對(duì)應(yīng)的位置上無(wú)干擾峰出現(xiàn)，且分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)大于4 000，表明方法專屬性良好，見(jiàn)圖1。

2.1.6 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液4、7、10、13、16 μL，進(jìn)樣測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X，μg），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得丹酚酸B 回歸方程為Y=10 06494.14X+391.8，r=1.000 0，進(jìn)樣量在0.16～0.63 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；綠原酸回歸方程為Y=2 895 406.89X-880.07，r=1.000 0，進(jìn)樣量在0.03～0.14 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 各成分高效液相色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of each constituent

2.1.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一份對(duì)照品溶液適量，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得丹酚酸B 和綠原酸峰面積RSD 值分別為1.21%、0.35%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取青紫顆粒（批號(hào)：201015）約0.5 g，共6 份，按“2.1.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得丹酚酸B 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.96 mg/g，其RSD 值為1.52%；綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.74 mg/g，其RSD值為0.55%。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取青紫顆粒（批號(hào)：201015）供試品溶液，于0、4、6、8、10、12、24 h 在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得丹酚酸B 和綠原酸峰面積RSD值分別為0.67%、1.15%。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)（丹酚酸B：2.96 mg/g；綠原酸：0.74 mg/g）的青紫顆粒（批號(hào)：201015）0.25 g，精密稱定9 份，分3 組，每組3 份，分別按樣品中丹酚酸B及綠原酸含有量與相應(yīng)對(duì)照品加入量的比例約為1∶0.8、1∶1、1∶1.2，加入丹酚酸B、綠原酸混合對(duì)照品儲(chǔ)備液（丹酚酸B：0.740 mg/mL；綠原酸：0.189 mg/mL）0.8、1.0、1.2 mL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 丹酚酸B加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Table 1 Results of recovery tests of salvianolic acid B

2.2 提取工藝考察

2.2.1 正交試驗(yàn) 以綠原酸及丹酚酸B 提取率為考察指標(biāo)，選取提取次數(shù)（A）、提取時(shí)間（B）、加水倍量（C）為影響因素，采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)選最佳水提工藝。因素水平見(jiàn)表3，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析結(jié)果見(jiàn)表5、表6。根據(jù)K 值直觀分析表確定最佳工藝為A2B1C3，即加12倍量水，提取2次，每次1 h。

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 按優(yōu)選工藝A2B1C3進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，即加12 倍量水，提取2 次，每次1 h，考察工藝穩(wěn)定性。驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表6，結(jié)果表明該提取工藝合理，穩(wěn)定可行。

2.3 濃縮溫度考察

以綠原酸及丹酚酸B 的提取率為考察指標(biāo)，對(duì)水提液的最佳濃縮溫度進(jìn)行考察。按照之前所考察的優(yōu)選工藝進(jìn)行提取，分別在60、70、80 ℃下減壓濃縮至一定體積（相對(duì)密度為1.05～1.10），放冷，加水復(fù)溶至原體積后測(cè)定綠原酸及丹酚酸B 的含量，計(jì)算不同溫度下濃縮前后綠原酸、丹酚酸B 的轉(zhuǎn)移率，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7，結(jié)果表明兩種成分幾乎沒(méi)有損失，濃縮溫度在80 ℃以下即可。

表2 綠原酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of recovery tests of chlorogenic acid(n=9)

表3 因素水平表Table 3 Design of factor and level

2.4 干燥溫度考察

按優(yōu)選的提取濃縮工藝得到稠膏，分別在60、70、80 ℃下減壓干燥一定的時(shí)間，得干浸膏，復(fù)溶后進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表8?？梢?jiàn)，干燥溫度在60～70 ℃時(shí)，2 種成分的損失率均在10%以內(nèi)，損失較少，表明干燥溫度在70 ℃以下即可。

2.5 樣品含量測(cè)定

采用優(yōu)選得到的提取濃縮干燥工藝參數(shù)進(jìn)行中試放大研究，將浸膏粉∶糊精∶蔗糖以5∶3∶2（質(zhì)量比）的比例混合均勻，加入0.04%糖精鈉為矯味劑，2%聚乙烯吡咯烷酮的95%乙醇溶液為潤(rùn)濕劑進(jìn)行制粒，并對(duì)所得中試樣品進(jìn)行測(cè)定。

取3 批青紫顆粒樣品（201015、201016、201017）按“2.1.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，并在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，分別計(jì)算丹酚酸B、綠原酸2 種成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表9。

表4 水提工藝直觀分析表Table 4 Visual analysis table of water extraction process

表5 綠原酸與丹酚酸B提取率方差分析表Table 5 Variance analysis of extraction rate of chlorogenic acid and salvianolic acid B

表6 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Verification test

表7 濃縮溫度考察結(jié)果Table 7 Results of concentration temperature（n=3）

表8 干燥溫度考察Table 8 Results of drying temperature（n=3）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇

在供試品溶液制備時(shí)，以青紫顆粒中的丹酚酸B 和綠原酸的提取率為指標(biāo)，首先對(duì)比考察了不同提取溶劑（甲醇、75%甲醇、水）[7-9]，結(jié)果顯示75%甲醇作為提取溶劑時(shí)，2 種檢測(cè)成分的提取率較佳，且無(wú)雜質(zhì)峰干擾。對(duì)不同溶劑倍量（25、50、100、150倍）進(jìn)行考察，結(jié)果顯示在溶劑倍量為50 倍時(shí)2 種成分已經(jīng)可以提取完全。最終選擇100 倍劑量即50 mL的75%甲醇為溶劑對(duì)供試品進(jìn)行提取。

表9 3批青紫顆粒中丹酚酸B、綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果Table 9 The contents of salvianolic acid B and chlorogenic acid in three batches of Qingzi granules w/(mg·g-1)

3.2 指標(biāo)性成分的選擇

本試驗(yàn)在保留青紫合劑水提工藝的基礎(chǔ)上對(duì)指標(biāo)性成分進(jìn)行篩選，青黛中靛玉紅提取率不足5%，故未選為指標(biāo)性成分，紫草中有效成分未檢出。最終選擇君藥茵陳中的綠原酸及臣藥丹參中的丹酚酸B為指標(biāo)性成分，結(jié)果重復(fù)性好，穩(wěn)定性佳。

3.3 流動(dòng)相和波長(zhǎng)的選擇

試驗(yàn)對(duì)甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸2 種流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行考察[10-12]，波長(zhǎng)的選擇參照2020 年版《中國(guó)藥典》選擇286 nm（丹酚酸B）與327 nm（綠原酸），以青紫顆粒中丹酚酸B 和綠原酸的峰形、分離效果和色譜圖中基線平穩(wěn)、雜質(zhì)干擾為指標(biāo)，結(jié)果顯示乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)效果較佳，最終選擇該系統(tǒng)，按照一定的流動(dòng)相比例作為樣品的測(cè)定條件。

3.4 提取工藝的選擇

由正交試驗(yàn)結(jié)果可知，綠原酸提取率的影響因素順序?yàn)锳＞C＞B，即提取次數(shù)＞加水倍量＞提取時(shí)間；丹酚酸B 提取率的影響順序?yàn)锳＞B＞C，即提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞加水倍量。方差分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)于綠原酸，提取次數(shù)的影響最顯著，根據(jù)K值直觀分析表可發(fā)現(xiàn)2 個(gè)指標(biāo)成分的最佳工藝均為A2B1C3，故選擇最優(yōu)提取工藝為A2B1C3，即加12 倍量水，提取2次，每次1 h。由濃縮及干燥溫度考察試驗(yàn)結(jié)果可知，此兩種成分在高溫下?lián)p失率均不太大，因此將濃縮溫度控制在80 ℃以下，干燥溫度在70 ℃以下即可，為今后的大規(guī)模生產(chǎn)提供了依據(jù)。

本研究采用HPLC 梯度洗脫法對(duì)青紫顆粒中丹酚酸B 和綠原酸進(jìn)行了同時(shí)測(cè)定，建立了青紫顆粒中多指標(biāo)質(zhì)量控制模式，所建立的含量測(cè)定方法操作簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確，為青紫顆粒質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了依據(jù)。