化妝品微生物污染檢測技術(shù)及應(yīng)對策略

隆婷 李晶 王梓煙 林婕 王亞婷

通過對化妝品微生物污染現(xiàn)狀的闡述，以及對菌落總數(shù)、糞大腸菌群、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、霉菌和酵母菌的檢測技術(shù)從常規(guī)方法和新技術(shù)兩方面進(jìn)行歸納總結(jié)，探討了新技術(shù)的發(fā)展方向;同時(shí)提出了減少化妝品微生物污染的應(yīng)對策略：針對微生物污染的來源，從產(chǎn)品生產(chǎn)過程和日常使用過程進(jìn)行控制;產(chǎn)品配方中加入適量的防腐劑，構(gòu)建良好的防腐體系，抑制微生物的生長與繁殖。

對化妝品微生物檢測的要求不僅要快速而且要準(zhǔn)確，可以應(yīng)用一些化妝品微生物快速檢測技術(shù)，例如ATP生物熒光增幅法、Petrifilm菌落總數(shù)測試方法、多重PCR技術(shù)等。減少化妝品微生物污染的研究：加強(qiáng)預(yù)防化妝品污染措施和微生物檢驗(yàn)?zāi)芰Φ难芯恳约巴晟苹瘖y品微生物陽關(guān)法規(guī);加強(qiáng)防腐劑對于微生物的抑菌l作用效果以及含抗菌劑化妝品的抗菌作用研究。

化妝品是指以涂擦、噴灑或者其他類似方法，施用于皮膚、毛發(fā)、指甲、口唇等人體表面，以清潔、保護(hù)、美化、修飾為目的的日用化學(xué)工業(yè)產(chǎn)品。[1]。隨著人們生活水平的逐步提高，化妝品已基本成為生活必需品，而大部分化妝品（尤其是護(hù)膚品）含有比較豐富的營養(yǎng)成分，如植物蛋白、海藻提取物、動(dòng)物蛋白等，可成為多種微生物生長、繁殖的良好培養(yǎng)基[2-3]，造成微生物污染。2017年，某醫(yī)學(xué)院校研究得出，化妝品中滋生的致病微生物主要有糞大腸菌群、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌以及霉菌和酵母菌。糞大腸菌群是人體腸道和體表重要的正常菌群，當(dāng)人體免疫力低下時(shí)，可誘發(fā)胃腸炎和各種腸道外感染，嚴(yán)重者可致敗血癥。而金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌對各種理化因素均具有較強(qiáng)的抵抗力，并且近年來臨床耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，可引起感染，導(dǎo)致各種器官化膿性炎癥甚至菌血癥和敗血癥[4]。霉菌毒素很多對人體有強(qiáng)烈的致癌作用，也可以引起腹瀉、嘔吐等癥狀。真菌污染，是誘發(fā)皮膚疾病和過敏反應(yīng)性疾病的關(guān)鍵因素，尤其是對免疫功能低下及過敏性體質(zhì)者危害更為突出。當(dāng)今社會(huì)化妝品微生物污染的狀況越發(fā)受到重視，所以對于其檢測技術(shù)的總結(jié)以及應(yīng)對策略的探討等方面是值得關(guān)注的。

化妝品微生物污染現(xiàn)狀

微生物污染來源

一般化妝品的微生物污染途徑包括一次污染和二次污染[5]。一次污染指化妝品生產(chǎn)過程中引起的微生物污染，包括原料、儀器、設(shè)備、生產(chǎn)、包裝過程及儲(chǔ)存條件等引起的微生物污染?；瘖y品中的成分，多半屬于富合營養(yǎng)的有機(jī)物質(zhì)，原料污染是一次污染的最大原因。人體在正常狀態(tài)下帶有無數(shù)微生物，這些微生物可以從生產(chǎn)人員體表帶到產(chǎn)品中，還有儀器設(shè)備清洗、消毒不完全或是未能按相關(guān)儲(chǔ)存要求儲(chǔ)存，通風(fēng)不暢、潮濕的環(huán)境以及內(nèi)容物密封不嚴(yán)等，也會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品的污染與變質(zhì)[6]。

二次污染主要是指化妝品使用過程中產(chǎn)生的污染，包括手部接觸化妝品后將微生物帶入，或空氣中的微生物落入使化妝品被污染。近年來，有很多探討影響化妝品二次污染因素的研究，可得出化妝品的種類、劑型、包裝方式、使用日期、保存方法以及個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣均可能引起化妝品二次污染[7-11]。

微生物污染現(xiàn)狀

化妝品微生物污染的常見污染菌包括國標(biāo)中提到的糞大腸菌群、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、霉菌和酵母菌。從2011年張丹、閔紅對市場中化妝品進(jìn)行隨機(jī)抽檢[12]到2020年曹婷婷、江艷芳等對508批化妝品進(jìn)行微生物檢驗(yàn)的研究[13]，可看出未開封化妝品的合格率總體都在90%以上且沒有明顯的變化趨勢。近幾年，關(guān)于化妝品二次污染檢測的研究較多[14-16]，研究結(jié)果顯示已使用過的化妝品的合格率低于未開封化妝品，且使用時(shí)間越長受污染程度越高。

就真菌而言，由于其具有分布范圍廣、易傳播等特點(diǎn)，易使化妝品受到污染。目前有關(guān)于化妝品真菌污染的研究一直在進(jìn)行和發(fā)展中，然而多限于對真菌數(shù)量的測定，而缺乏對致病種類的關(guān)注。

2013年，李萌等對受污染面膜進(jìn)行了菌株分離培養(yǎng)，通過形態(tài)觀察并結(jié)合分子生物學(xué)手段，對其中真菌的種類進(jìn)行了精細(xì)分類，分離到的菌株有Scopu[ariopsis brevicaulis（短帚霉）、Penici[[ium chrysogenum（青霉菌）、A＼ternaria（鏈格孢霉）、Cladosporium cladosporioides（枝狀枝孢霉），明確了化妝品易污染真菌的種類。上述這些真菌的污染，對化妝品的質(zhì)量和使用者的身體健康情況會(huì)造成巨大威脅[17]。

評估化妝品微生物污染除了檢測常見污染菌外，其他的特殊污染菌也有著重要的檢測意義。

韶關(guān)學(xué)院醫(yī)學(xué)院的幾個(gè)學(xué)生選取了2015年6月至2016年5月韶關(guān)學(xué)院醫(yī)學(xué)院在校大學(xué)生使用的化妝品作為研究對象，隨機(jī)抽取了139份在校大學(xué)生使用中的化妝品進(jìn)行微生物衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)，結(jié)果在抽取樣品中共檢出糞大腸菌群3株，金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯菌各2株，銅綠假單胞菌、變異庫克菌、黏質(zhì)沙雷菌和產(chǎn)堿菌屬各1株[18]。

2020年江西省藥品檢驗(yàn)檢測研究院、國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等在化妝品樣品中檢出菌落總數(shù)超標(biāo)，并經(jīng)VITEK2COM PACT自動(dòng)微生物快速檢測分析系統(tǒng)鑒定出污染菌有豕鏈球菌（Streptococcusporcinus）、玫瑰色考克氏菌（Kocuria rosea）、成團(tuán)泛菌（Pantoea agg[omerans）[19]。豕鏈球菌為鏈球菌屬，在肺炎病例中偶爾會(huì)檢測出此菌，近年來，國外有報(bào)道該菌有可能是早產(chǎn)胎膜破裂和宮頸功能不全的發(fā)病機(jī)制[20];玫瑰色考克氏菌為革蘭氏陰性球菌、考克氏菌屬、耐輻射微生物，可作為化妝品質(zhì)量評定的指標(biāo)菌株;成團(tuán)泛菌是革蘭氏陰性的有氧芽孢桿菌，該病原菌的報(bào)道很少，國外有報(bào)道稱其可能引起兒童腦膜炎及血液相關(guān)性疾病[21]。

化妝品微生物檢測技術(shù)的探討

《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》（2015版）（以下簡稱“《規(guī)范》”）中明確規(guī)定，在進(jìn)行樣品前處理后，即針對菌落總數(shù)、糞大腸菌群、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌，霉菌和酵母菌這五個(gè)微生物檢測指標(biāo)進(jìn)行相應(yīng)的檢測。

針對菌落總數(shù)，《規(guī)范》中規(guī)定的方法是常規(guī)的菌落計(jì)數(shù)方法，可操作性強(qiáng)，但步驟繁雜，準(zhǔn)確度低。朱世真等人通過對14批化妝品人工添加3種常見試驗(yàn)菌，對《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》和Petrifilm菌落總數(shù)測試方法進(jìn)行比對。兩種方法檢測結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn)表明兩種方法相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論表明：Petrifilm菌落總數(shù)測試片法因其輕便、快速、簡易的優(yōu)勢在化妝品的微生物檢測中具有重要意義[22]。

針對糞大腸菌群、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌三種致病菌，《規(guī)范》用到的是普通的增菌分離培養(yǎng)法，對可疑菌落進(jìn)行生化鑒定。該方法需要配制各種培養(yǎng)基和試劑，操作繁瑣，耗時(shí)4～7天，且存在對一些致病性金黃色葡萄球菌、糞大腸菌群檢出率很低的問題，且三種致病菌沒有實(shí)現(xiàn)同步檢測，每種菌采用單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢驗(yàn)。為了解決這些問題，化妝品微生物檢測的發(fā)展也進(jìn)入尋找更快速、檢出率更高的新方法階段。

翟磊[23]等人前期基于ATP生物熒光技術(shù)建立了一套適用于微生物快速檢測的ATP生物熒光增幅法，具有檢測速度快、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，可在48h內(nèi)實(shí)現(xiàn)樣品中細(xì)菌、霉菌和酵母菌的定性檢驗(yàn)。但檢測成本較高。

謝永強(qiáng)[24]等人將用于化妝品中BioLumix微生物熒光光電檢測系統(tǒng)與《規(guī)范》微生物檢測法進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示兩種方法的結(jié)果基本一致，但檢測時(shí)效性有明顯差異?！兑?guī)范》微生物檢測法檢測化妝品并出具可靠的檢測報(bào)告需要5天，而BioLumix系統(tǒng)檢測化妝品細(xì)菌項(xiàng)目和霉菌、酵母項(xiàng)目可在16h和35h內(nèi)分別發(fā)出預(yù)警，并可在48h內(nèi)完整地輸出檢測報(bào)告。BioLumix系統(tǒng)檢測速度快，但同樣是檢測成本高，需要配備BioLumix微生物熒光光電檢測儀器。

楊秀茳[25]等人利用多重PCR技術(shù)建立快速檢測化妝品中三種致病菌的方法。根據(jù)已報(bào)道的大腸桿菌phoA基因、銅綠假單胞菌外膜蛋白基因oprL和金黃色葡萄球菌特異性序列Smal選擇特異性引物，對人工染菌化妝品進(jìn)行多重PCR檢測。結(jié)果顯示，三種致病菌的基因組DNA均可與各自引物特異性結(jié)合，擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為622bp、504bp和426bp。該方法用于人工污染的化妝品中，大腸桿菌的檢出限濃度為103CFU/mL，銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的檢出限濃度為105CFU/mL。其建立的多重PCR方法可同時(shí)快速、特異地對化妝品中三種致病菌進(jìn)行檢測，在化妝品行業(yè)具有較大的應(yīng)用價(jià)值。但該方法操作較常規(guī)方法成本高。

不難發(fā)現(xiàn)，新的技術(shù)聚焦于實(shí)現(xiàn)多個(gè)檢驗(yàn)指標(biāo)的同步檢測，在快速檢驗(yàn)的同時(shí)達(dá)到較高的檢出率和準(zhǔn)確度。

這三種常見的致病菌的新的檢測方法也在不斷被探索，經(jīng)過不斷發(fā)展將可應(yīng)用于化妝品微生物高通量檢驗(yàn)。

如目前在金黃色葡萄球菌快速檢測方面迅速發(fā)展的免疫磁珠技術(shù)。周莉[26]等人利用羧基聚苯乙烯磁性微球、兔抗金黃色葡萄球菌多克隆抗體進(jìn)行分離富集，將這一技術(shù)應(yīng)用于食品中的金黃色葡萄球菌檢測。將這一分離富集技術(shù)與其他快檢方法結(jié)合可大大提高檢測的靈敏度等各項(xiàng)指標(biāo)。如：免疫磁珠一多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[27]、免疫磁珠富集-PCR法[28]、免疫磁珠一環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[29]、免疫磁珠-ATP發(fā)光檢測[30]技術(shù)。這些方法目前都在食源性病原微生物檢測及醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域得到快速發(fā)展，將這一技術(shù)與恰當(dāng)?shù)臉悠非疤幚矸椒ńY(jié)合應(yīng)用于化妝品微生物檢驗(yàn)方面將建立一種快速高靈敏度的方法。

對于化妝品中常見的污染菌銅綠假單胞菌，不同的銅綠假單胞菌菌株中發(fā)現(xiàn)的完整基因組包括10000 - 40000個(gè)基因，菌株之間的基因組排列可能有所不同，難以鑒定適合基因標(biāo)記的區(qū)域。因此，該菌的代謝組學(xué)是研究重點(diǎn)[31]，新的研究聚焦于找出除綠膿菌素外其他的代謝物。對于常見的大腸桿菌的檢測，新的方法主要以與光電分析技術(shù)結(jié)合為著手點(diǎn)，如：王毅夢[32]等提出的基于碳納米管修飾的DNA電化學(xué)傳感器用于大腸桿菌基因片段檢測。

而針對霉菌和酵母菌這一檢驗(yàn)指標(biāo)，《規(guī)范》規(guī)定的常規(guī)培養(yǎng)檢測周期長、檢出率低，今后的發(fā)展更趨向于采用分子學(xué)技術(shù)。李萌[17]等提出的基于ITS序列的化妝品中污染真菌檢測與鑒定，該方法克服了常規(guī)方法的問題，在分子水平上進(jìn)行真菌檢測，但成本較高，可操作性不強(qiáng)。

化妝品微生物污染的應(yīng)對策略

在化妝品的日常使用過程中，微生物污染也是不可避免的。對于微生物污染的控制，主要是加強(qiáng)對企業(yè)的監(jiān)管，一方面是針對微生物污染的來源，從產(chǎn)品生產(chǎn)過程和日常使用過程進(jìn)行控制;另一方面，是在產(chǎn)品配方中加入適量的防腐劑，在產(chǎn)品內(nèi)部構(gòu)建一個(gè)良好的防腐體系，抑制微生物的生長與繁殖。

產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的監(jiān)控

防止原料的污染

化妝品原料種類繁多，原料的質(zhì)量在很大程度上決定成品的質(zhì)量，所以，在化妝品的生產(chǎn)過程中必須建立原材料的檢測程序，制定原料的微生物檢測指標(biāo)，采用嚴(yán)格的殺菌、除菌方法。原料貯存時(shí)容易污染，應(yīng)采用防潮容器，按規(guī)定的溫度保存，在保質(zhì)期內(nèi)使用?；瘖y品用水一般采用去離子水或蒸餾水，貯存幾天后會(huì)產(chǎn)生各種雜菌。為保證用水的質(zhì)量，應(yīng)每日檢測水中的微生物，保證微生物不超標(biāo)。

防止環(huán)境和設(shè)備的污染

嚴(yán)格規(guī)定生產(chǎn)環(huán)境中空氣系統(tǒng)，包括進(jìn)入空氣的質(zhì)量、溫度、濕度、交換速度和系統(tǒng)設(shè)計(jì)對空氣純度的要求，并且要考慮進(jìn)、出通風(fēng)口的位置，以及控制氣流模式的管道的布置。在潮濕地區(qū)，需定期對墻壁、天花板、地板、鍋釜、攪拌漿、供料管和用具進(jìn)行強(qiáng)力清洗和殺菌消毒。

防止成品包裝污染

成品包裝材料（桶、瓶、蓋）的不衛(wèi)生會(huì)造成化妝品的微生物污染，需要清洗后再投入使用。最常見的包裝包括玻璃瓶、塑料瓶、復(fù)合塑料袋、塑料軟管等。而紙盒常用作中、高檔化妝品的外包裝。中、低價(jià)位的護(hù)膚品大多使用復(fù)合塑料袋、塑料軟管和塑料瓶;而高檔產(chǎn)品更為青睞玻璃瓶，特別是香水包裝，絕大多數(shù)都使用的是玻璃容器。提高各類成品包裝的衛(wèi)生潔凈程度是保持化妝品質(zhì)量的措施之一。

防止操作人員的污染

人的皮膚、鼻、耳、口等均有微生物存在，良好的個(gè)人衛(wèi)生是控制微生物污染的有效方法，不執(zhí)行良好個(gè)人衛(wèi)生的員工將使以上所述的所有工作失去效果，操作人員應(yīng)穿戴清潔專用的衛(wèi)生服、衛(wèi)生帽、衛(wèi)生鞋，同時(shí)生產(chǎn)人員的手應(yīng)進(jìn)行消毒。

關(guān)于應(yīng)用防腐劑

1.采取復(fù)合型防腐劑。與單一防腐劑相比，其優(yōu)點(diǎn)主要包括拓寬抑菌譜、提高抑菌活性、延長使用期限。復(fù)合型防腐劑既能保證化妝品質(zhì)量的安全，又能防止使用過程中的再污染。

2.應(yīng)采用安全度較高的防腐劑。使用低毒、無毒和無刺激的防腐劑，例如采用新興的天然防腐劑，其主要是從動(dòng)植物或微生物中提取。

3.開發(fā)具有功能性的新型防腐劑?；瘖y品的防腐劑應(yīng)加強(qiáng)其防腐作用，也可以有抗衰老、美白及祛痘等其他功效，對皮膚問題有針對性，如植物提取物，從甘草中提取的甘草酸除了具有抑菌效果外，還具有抗氧化、美白和消炎等功效作用[33];丁香酚也具有抑菌、消炎和抗氧化等作用效果[34]。

減少二次污染的策略

1.在購買化妝品前，不但要注意其生產(chǎn)日期和使用期限，同時(shí)也要關(guān)注其種類、包裝方式和價(jià)格。不能因美觀的包裝或者低廉的價(jià)格，而忽略了質(zhì)量;否則，選擇的化妝品很可能引發(fā)相關(guān)的微生物污染，導(dǎo)致皮膚或身體受到危害。

2.在化妝品使用過程中更應(yīng)該關(guān)注其微生物的污染狀況。要時(shí)常檢查使用期限，避免超期過長，一旦發(fā)現(xiàn)過期，就應(yīng)該停止使用及時(shí)更換;在使用前可以做小部位的使用，避免微生物污染嚴(yán)重導(dǎo)致對身體產(chǎn)生危害，若發(fā)現(xiàn)不適，及時(shí)停止使用。

3.開封后的化妝品應(yīng)該妥善保存。研究數(shù)據(jù)顯示，在非避光條件下保存的化妝品污染較重，在潮濕環(huán)境下保存的化妝品污染更嚴(yán)重，所以我們應(yīng)該將化妝品置于非避光且干燥的地方保存，減少微生物的污染。

結(jié)論與展望

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，化妝品成為人們?nèi)粘Ｉ畹谋匦杵?，其微生物污染也成為社?huì)關(guān)注的重點(diǎn)問題。污染的微生物可能存在致病性或條件致病性微生物，而這些污染微生物傳播的方式主要包括二次污染中消費(fèi)者使用不潔凈的手涂抹、不潔凈的化妝品用具、容器敞開、包裝設(shè)計(jì)不科學(xué)等。污染微生物產(chǎn)生的某些代謝產(chǎn)物，可刺激皮膚發(fā)生炎癥或過敏反應(yīng)，對人體造成的危害會(huì)產(chǎn)生不可估量的風(fēng)險(xiǎn)，因此，規(guī)范對化妝品質(zhì)量的有效監(jiān)督和管理十分重要。目前，化妝品微生物的檢測技術(shù)正朝著快速、簡便、準(zhǔn)確的方向發(fā)展，主要方法包括ATP生物熒光增幅法、Petrifi[m菌落總數(shù)測試方法、多重PCR技術(shù)等?；瘖y品質(zhì)量控制的發(fā)展趨勢是在化妝品微生物檢驗(yàn)?zāi)芰ι喜粩嗉訌?qiáng)，且化妝品微生物檢測法規(guī)也將更加完善。為了讓消費(fèi)者能更加放心地使用化妝品，采用抗菌作用廣、低刺激、溫和型防腐劑以及含抗菌性化妝品已成為當(dāng)前社會(huì)化妝品研發(fā)的熱點(diǎn)。[作者來自南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院?；痦?xiàng)目：國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目（201910555050）]

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