不同地區(qū)黃秋葵根結(jié)線蟲的SCAR鑒定及其防治

練冬梅 賴正鋒 姚運(yùn)法

摘要：根結(jié)線蟲病是黃秋葵生產(chǎn)中的重要地下病害，危害黃秋葵植株的生長(zhǎng)，降低其產(chǎn)量。采用序列特異性擴(kuò)增區(qū)聚合酶鏈反應(yīng)（SCAR-PCR）技術(shù)鑒定不同地區(qū)黃秋葵上根結(jié)線蟲的種類，并通過4種不同措施防治黃秋葵根結(jié)線蟲。結(jié)果表明，在福建省漳州市龍文區(qū)、福建省三明市永安市和福建省莆田市秀嶼區(qū)，黃秋葵根結(jié)線蟲的種類為南方根結(jié)線蟲，10.2%阿維噻唑膦顆粒劑的防治效果最好，為今后黃秋葵根結(jié)線蟲病的防治研究提供了理論參考。

關(guān)鍵詞：黃秋葵;根結(jié)線蟲;SCAR;防治

黃秋葵（Abelmoschus esculentus L.）屬錦葵科（Malvaceae）秋葵屬（Abelmoschus）[1]，別稱秋葵（okra）、補(bǔ)腎草、咖啡葵等，為一年或多年生草本植物，原產(chǎn)于非洲，20世紀(jì)20年代初從印度引入我國(guó)，現(xiàn)在國(guó)內(nèi)各地均有栽培。黃秋葵作為一種特色的保健型蔬菜，在廣東、福建、山東等地區(qū)均有大規(guī)模種植[2]，在福建省不同地區(qū)，每年的黃秋葵種植面積累計(jì)達(dá)到2 000 hm2，在福建建寧、泰寧和將樂等地區(qū)，黃秋葵品種洋辣、癡椒的種植歷史已有百年之久[3]。由于黃秋葵生產(chǎn)的規(guī)模化、設(shè)施化和連作化且絕大部分黃秋葵易受根結(jié)線蟲侵染[4]，根結(jié)線蟲病已經(jīng)成為世界上黃秋葵分布最廣、危害最大的植物寄生線蟲之一，嚴(yán)重影響了黃秋葵的生長(zhǎng)和產(chǎn)量[5]。因此，黃秋葵根結(jié)線蟲病防控技術(shù)的研究受到越來(lái)越多的關(guān)注，研究?jī)?nèi)容包括黃秋葵嫁接玫瑰茄砧木[6]、篩選抗病品種[4-5，7-8]等手段。本研究采用序列特異性擴(kuò)增區(qū)聚合酶鏈反應(yīng)（SCAR-PCR）快速檢測(cè)技術(shù)鑒定黃秋葵根結(jié)線蟲種類，并研究不同技術(shù)措施對(duì)黃秋葵根結(jié)線蟲的防治效果，以期為今后黃秋葵根結(jié)線蟲病的防治研究提供理論參考。1 材料與方法

1.1 SCAR-PCR鑒定

1.1.1 樣品采集 于2019年7月分別采集福建省漳州市龍文區(qū)、三明市永安市、莆田市秀嶼區(qū)黃秋葵生長(zhǎng)后期的根樣。采樣方法以5點(diǎn)式為主，剪去植株地上部后將5～10株黃秋葵的根系放在1個(gè)塑料袋中作為根樣。

1.1.2 線蟲的分離 在解剖鏡下直接用挑針挑出發(fā)病根樣中的雌蟲，用液氮處理后于-70 ℃冰箱中保存。

1.1.3 單條線蟲DNA的提取 線蟲DNA提取參考王江嶺等的方法[9]。將單條根結(jié)線蟲雌蟲放入含有8 μL ddH2O、1 μL 10×Ex Taq buffer（Mg2+ free）的200 μL PCR管中，在液氮中冷凍1 min后，于95 ℃處理2 min，重復(fù)3次，向PCR管中加入1 μL 1 mg/mL蛋白酶K，于65 ℃溫育1 h后，于 95 ℃ 靜置10 min。用掌上離心機(jī)瞬時(shí)離心，上清液即可用于PCR擴(kuò)增或置于-20 ℃冰箱中備用。

1.1.4 PCR引物 本研究采用的SCAR標(biāo)記引物見表1。

1.1.5 PCR擴(kuò)增與電泳 PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用 25 μL 體系，包括5 μLDNA模板，1 μL F引物，1 μL R引物，12.5 μL 2×Taq MasterMix（含染料），4.5 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃ 變性30 s，退火30 s（溫度參照表1），72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在濃度為1.2%的瓊脂糖凝膠上檢測(cè)擴(kuò)增片段的大小，以DNA marker DL 2000作為分子量對(duì)照。電泳完畢后在溴化乙錠（EB）染液中染色10 min，用凝膠成像儀觀察并拍照。

1.2 防治技術(shù)研究

1.2.1 材料與藥劑 供試黃秋葵品種閩秋葵3號(hào)由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所選育[14]。淡紫擬青霉顆粒劑（含5億活孢子/g，處理1）、10%阿維菌素顆粒劑（處理2）、10.2%阿維噻唑膦顆粒劑（處理3）、生菜（處理4）種子均為市售。

1.2.2 試驗(yàn)方法 2019年8月，選擇根結(jié)線蟲發(fā)生較重的福建省漳州市龍文區(qū)朝陽(yáng)鎮(zhèn)登科村福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)研究所蔬菜種植基地進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)設(shè)1個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積為24 m2。處理1～3的施藥方法嚴(yán)格按照說(shuō)明進(jìn)行，處理4為黃秋葵幼苗定植前20 d，在栽培壟兩側(cè)條播誘集根結(jié)線蟲的生菜種子，黃秋葵定植 35 d 后，將生菜連根拔除。黃秋葵移栽60 d后，采用5點(diǎn)隨機(jī)取樣法，每個(gè)點(diǎn)取3株，每個(gè)小區(qū)共取樣15株，取樣后記錄發(fā)病級(jí)數(shù)。CK為清水處理。

1.2.3 根結(jié)線蟲病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 0級(jí)，無(wú)根結(jié);1級(jí)，僅有少量根結(jié)，1% ≤根結(jié)百分率<10%;2級(jí)，根結(jié)明顯，10% ≤根結(jié)百分率<25%;3級(jí)，25%≤根結(jié)百分率<50%;4級(jí)，50%≤根結(jié)百分率<75%;5級(jí)，根結(jié)百分率≥ 75%。

根結(jié)線蟲病病情指數(shù)=[（病級(jí)數(shù)×該級(jí)病株數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×最高病級(jí)數(shù)）]×100;

防治效果=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

1.2.4 根結(jié)線蟲蟲口密度調(diào)查 采用5點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)取0～40 cm土層的病土，將5點(diǎn)取到的土樣混勻后從中稱取100 g，用貝爾曼漏斗法分離土壤中的二齡幼蟲，將二齡幼蟲懸浮液充分混勻后，取2 mL液體定容，從中吸取100 μL于皿底打格的培養(yǎng)皿中，在解剖鏡下對(duì)二齡幼蟲進(jìn)行計(jì)數(shù)，重復(fù)3次，取平均值。每個(gè)處理小區(qū)的二齡幼蟲總量統(tǒng)一換算成1 kg土樣中的幼蟲總量。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 用DPS進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCAR分子鑒定結(jié)果

利用5種常見根結(jié)線蟲的特異性引物（表1）對(duì)福建省漳州市龍文區(qū)、福建省三明市永安市、福建省莆田市秀嶼區(qū)所采集樣本中分離得到的根結(jié)線蟲進(jìn)行擴(kuò)增與電泳觀察，得到的片段均為1 000 bp左右（圖1），與前人所得擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致[10]，確定根結(jié)線蟲的種類為南方根結(jié)線蟲（Meloidogyne incognita），但未檢出其他根結(jié)線蟲種類。

2.2 防治效果分析

2.2.1 病情指數(shù)和防治效果統(tǒng)計(jì) 試驗(yàn)結(jié)果表明，4種不同措施對(duì)黃秋葵根結(jié)線蟲病均有一定的防治效果（表2），其中淡紫擬青霉（含5億活孢子/g）顆粒劑、1.0%阿維菌素顆粒劑、10.2%阿維噻唑膦顆粒劑、種植誘集根結(jié)線蟲的生菜的防治效果分別為36.4%、33.1%、67.5%、39.5%，其中10.2%阿維噻唑膦顆粒劑的防治效果最好。

2.2.2 根結(jié)線蟲蟲口密度統(tǒng)計(jì) 由表3可以看出，4種不同措施對(duì)黃秋葵根結(jié)線蟲蟲口密度均有一定的降低作用，淡紫擬青霉（含5億活孢子/g）顆粒劑、1.0%阿維菌素顆粒劑、10.2%阿維噻唑膦顆粒劑、種植誘集根結(jié)線蟲的生菜的二齡幼蟲蟲口下降效果分別為37.4%、36.0%、60.7%、40.6%，其中10.2%阿維噻唑膦顆粒劑對(duì)根結(jié)線蟲蟲口密度的下降效果最佳。

3 討論

我國(guó)已報(bào)道的根結(jié)線蟲種類為57種，其中能引起蔬菜發(fā)生根結(jié)線蟲病的主要為南方根結(jié)線蟲（M. incognita）[15]、象耳豆根結(jié)線蟲（M. enterolobii）[16]、爪哇根結(jié)線蟲（M. javanica）[17]、北方根結(jié)線蟲（M. hapla）[18]、花生根結(jié)線蟲（M. arenaria）[19]。常規(guī)的根結(jié)線蟲種類鑒定方法主要有形態(tài)學(xué)鑒定法、寄主及生化鑒定法。近十幾年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，為根結(jié)線蟲的準(zhǔn)確鑒定提供了重要手段。其中，序列特異性擴(kuò)增區(qū)（sequence characterized amplified region，簡(jiǎn)稱SCAR）是一種新型分子標(biāo)記，結(jié)果穩(wěn)定性好、可重復(fù)性強(qiáng)，已被廣泛應(yīng)用于植物根結(jié)線蟲的種類鑒定中[20-22]。本研究通過SCAR-PCR方法，從分子水平對(duì)不同地區(qū)根結(jié)線蟲的種類進(jìn)行了準(zhǔn)確檢測(cè)和鑒定。世界范圍內(nèi)發(fā)現(xiàn)的危害黃秋葵的根結(jié)線蟲主要是南方根結(jié)線蟲（M. incognita）和象耳豆根結(jié)線蟲（M. enterolobii）[6，23-25]。我國(guó)黃秋葵以南方根結(jié)線蟲為主要種群，黃英凱鑒定得出，福建漳平地區(qū)黃秋葵的根結(jié)線蟲病原為南方根結(jié)線蟲[24];姚玉榮等鑒定得出，天津地區(qū)黃秋葵的根結(jié)線蟲病原為南方根結(jié)線蟲[25]。本研究結(jié)果顯示，危害福建省漳州市龍文區(qū)、福建省三明市永安市、福建省莆田市秀嶼區(qū)黃秋葵的根結(jié)線蟲種類與我國(guó)黃秋葵上主要根結(jié)線蟲種類相符，研究暫未發(fā)現(xiàn)其他根結(jié)線蟲。

目前，防治根結(jié)線蟲的方法有輪作、藥劑防治、生物防治、抗病品種等。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用田間不同措施對(duì)黃秋葵根結(jié)線蟲病均有一定防治效果，能夠減輕根結(jié)線蟲的危害，降低病情指數(shù)和蟲口密度，其中10.2%阿維噻唑膦顆粒劑的防效最好，具有速效性好、殘留毒性低、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，可作為當(dāng)前黃秋葵根結(jié)線蟲防治的最佳藥劑選擇，但防治成本偏高，而1.0%阿維菌素顆粒劑、淡紫擬青霉（含5億活孢子/g）顆粒劑和種植誘集根結(jié)線蟲生菜的防效一般，但防治成本低，其中誘集根結(jié)線蟲的生菜連根拔除后可出售，從而增加生產(chǎn)效益。淡紫擬青霉顆粒劑在可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展中的作用仍然十分重要，其高效防治技術(shù)還需不斷提升。

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