基因工程抗體及其在識(shí)別小分子中的應(yīng)用

王沁蕓，潘 曄，陳克平，王慧英，呂 鵬

（1.江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院，鎮(zhèn)江212013；2.江蘇維爾生物科技有限公司，常州213003）

基因工程抗體，也稱重組抗體，是通過(guò)基因工程和重組抗體技術(shù)獲得的高質(zhì)量第三代抗體，是從雜交瘤、免疫脾細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞等中提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR 擴(kuò)增出抗體基因，按一定方式連接到表達(dá)載體中，在適當(dāng)?shù)募?xì)胞中表達(dá)并折疊成有功能的抗體分子片段。相對(duì)于雜交瘤技術(shù)需要幾個(gè)月以上時(shí)間才能生產(chǎn)抗體，基因工程抗體僅需幾周就能在細(xì)菌、酵母或其他細(xì)胞中產(chǎn)生［1］，并基本消除抗體的免疫原性，生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，廉價(jià)易得，應(yīng)用前景廣闊。

基因工程抗體已用于治療、診斷、檢測(cè)等領(lǐng)域的藥物或產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，涉及對(duì)小分子的識(shí)別。小于1 ku 的小分子，包括寡肽、寡糖、寡核苷酸、維生素、礦物質(zhì)、小分子團(tuán)水、動(dòng)植物的代謝產(chǎn)物等，不能單獨(dú)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)產(chǎn)生抗體。這些小分子通常與載體蛋白綴合以觸發(fā)免疫反應(yīng)，因此易產(chǎn)生載體效應(yīng)，難以獲得高特異性抗體?；蚬こ炭贵w與體外展示技術(shù)結(jié)合可完全排除載體蛋白的干擾。在構(gòu)建抗體文庫(kù)［2］和大規(guī)模淘選時(shí)使用不同的載體蛋白，能快速富集僅識(shí)別小分子特異性抗體。通過(guò)改變淘選條件，可在增強(qiáng)特異性的同時(shí)提高抗體的穩(wěn)定性和親和力［3］。

1 基因工程抗體種類

根據(jù)抗體基因的不同來(lái)源，基因工程抗體可分為嵌合抗體、改型抗體、全人源化抗體等。嵌合抗體基因通常由鼠源可變區(qū)基因和人源恒定區(qū)基因拼接而成，保留高特異性和親和力的同時(shí)大大降低了異源抗體引起的不良反應(yīng)。改型抗體是將鼠源互補(bǔ)決定區(qū)基因接入人抗體骨架得到的抗體，可基本消除免疫原性。全人源化抗體的基因全部來(lái)自人抗體基因。

根據(jù)抗體結(jié)構(gòu)，基因工程抗體包括抗原結(jié)合片段（Fragment antigen?binding，F(xiàn)ab）、單鏈抗體（Single?chain variable fragment，scFv）、單域抗體（Single?do?main antibody，sdAb）等（圖1）［4］。Fab 是抗體上與抗原結(jié)合的區(qū)域，包含輕鏈可變區(qū)（VL）、恒定區(qū)和重鏈可變區(qū)（VH）、CH1 區(qū)。與Ig（約155 ku）相比，F(xiàn)ab 體積小，易于在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá)，組織穿透能力強(qiáng)［5］；與其他重組抗體相比，F(xiàn)ab 免疫原性低、親和力高，近幾年廣泛應(yīng)用于預(yù)防、診斷、治療等領(lǐng)域。scFv 是VH 與VL 的融合蛋白，連接肽通常富含甘氨酸以提高柔韌性，可將VH 的N 端（或C 端）與VL 的C 端（或N 端）相連［7］。雖然去除了C 區(qū)并加入連接肽，但scFv 仍然保留了原免疫球蛋白的特異性［8］。sdAb 也稱納米抗體，它的發(fā)現(xiàn)基于駱駝和鯊魚(yú)體內(nèi)天然缺失輕鏈的重鏈抗體。sdAb 是已知最小的功能性抗原結(jié)合片段，大小僅14 ku［9］，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于在細(xì)菌和酵母［10］中表達(dá)，特別適合基因工程方法［11］。sdAb 可溶性好，穩(wěn)定性高，可用于探索抗原受體起源、研發(fā)疫苗、治療藥物、診斷試劑和生物技術(shù)研究工具等。scFv 是最常用的抗體類型，可能是因?yàn)榭紤]到抗體與小分子的結(jié)合效率。雖然sdAb 可單獨(dú)識(shí)別小分子，但親和力往往不夠理想。scFv 是滿足VH 和VL 同時(shí)存在的最小的抗體片段。雖然Fab 也有VH 和VL，但兩個(gè)C 區(qū)和中間的鉸鏈區(qū)使其分子體積比scFv 大了一倍多。且C 區(qū)不參與小分子的識(shí)別與結(jié)合，其主要功能是維持抗體分子的穩(wěn)定，所以單從親和力角度考慮，F(xiàn)ab 與scFv相比沒(méi)有特別的優(yōu)勢(shì)，反而雙倍的體積會(huì)在構(gòu)建抗體文庫(kù)和淘選過(guò)程中帶來(lái)不便。雖然缺失C 區(qū)而易于多聚化一直是scFv 的不足，但通過(guò)開(kāi)發(fā)雙特異性抗體可以克服這個(gè)缺點(diǎn)。

圖1 不同基因工程抗體形式［4］Figure 1 Different genetically engineered antibody formats［4］

2 基因工程抗體的制備

抗體庫(kù)技術(shù)是制備基因工程抗體的主要方法，分為構(gòu)建和篩選兩個(gè)過(guò)程。構(gòu)建抗體庫(kù)是在DNA 水平上獲得抗體可變區(qū)基因并克隆到載體中，在展示系統(tǒng)中表達(dá)抗體以便通過(guò)淘選富集陽(yáng)性克隆，最后利用抗原篩選出攜帶特異性抗體基因的克隆，進(jìn)行鑒定與分析。不同的展示系統(tǒng)其原理不盡相同，在構(gòu)建和篩選抗體庫(kù)的方法上也有所差別，各具優(yōu)勢(shì)。

2.1 抗體庫(kù)構(gòu)建

根據(jù)抗體基因的來(lái)源可將抗體庫(kù)分為天然庫(kù)、合成庫(kù)和免疫庫(kù)。天然庫(kù)的V 基因來(lái)自未免疫個(gè)體的抗體基因。構(gòu)建高度多樣性的天然抗體庫(kù)需要花費(fèi)大量精力，但構(gòu)建成功后可以反復(fù)使用，針對(duì)多種抗原進(jìn)行篩選。然而，由于抗體基因來(lái)自人或動(dòng)物免疫系統(tǒng)，所以無(wú)法保證通過(guò)篩選獲得的克隆能在細(xì)菌中表達(dá)。此外，天然庫(kù)篩出的抗體常常會(huì)引起宿主菌的不良表達(dá)或?qū)ζ洚a(chǎn)生毒性，這些問(wèn)題可以通過(guò)合成抗體庫(kù)來(lái)解決［12］。天然抗體庫(kù)一般不適合在沒(méi)有載體分子的情況下分離識(shí)別小分子的抗體。合成庫(kù)不受天然免疫系統(tǒng)的限制，因此更有可能包含目的抗體。全合成庫(kù)是通過(guò)克隆生殖系DNA 抗體基因序列構(gòu)建的。VH、D、J或Vκ／λ、Jκ／λ 基因片段在體外進(jìn)行排列組合，重組成完整的VH 和VL 基因。隨后將合成庫(kù)克隆到表達(dá)載體中，可生成107～1010的文庫(kù)。已有研究從合成庫(kù)中分離出蛋白和半抗原的特異性抗體，但親和力一般不高。免疫庫(kù)是為代替雜交瘤而最先被開(kāi)發(fā)出的抗體庫(kù)，具有庫(kù)容小但特異性和親和力高的特點(diǎn)。通常將小分子與載體蛋白偶聯(lián)后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行注射免疫，動(dòng)物體內(nèi)對(duì)此抗原產(chǎn)生高水平的抗體，在總抗體mRNA 中高度表達(dá)對(duì)應(yīng)的抗體mRNA。因此，即使來(lái)自免疫供體的抗體文庫(kù)庫(kù)容只有105，也能產(chǎn)生特異性抗體，并且由于抗體基因在體內(nèi)已經(jīng)經(jīng)歷了親和力成熟，所以不需要進(jìn)一步提高親和力。免疫庫(kù)已被用于篩選病毒表面抗原、細(xì)菌霉素、細(xì)胞表面腫瘤抗原的特異性抗體，其KD值低至10-10mol/L。在構(gòu)建免疫抗體庫(kù)時(shí)，用多種抗原免疫單只動(dòng)物可同時(shí)獲得多種特異性高親和力抗體［13］。

2.2 抗體庫(kù)篩選

基因工程抗體的體外分離取決于篩選大型抗體基因組合文庫(kù)以分離出與靶分子特異性結(jié)合的克隆的能力。大多數(shù)免疫技術(shù)應(yīng)用都需要篩選105～1011大小的抗體庫(kù)，所以必須開(kāi)發(fā)出高效、高通量的篩選技術(shù)。過(guò)去30 年來(lái)，各種技術(shù)的復(fù)雜性和靈敏度不斷提高，已從大量抗體庫(kù)中分離高親和力抗體。展示技術(shù)是目前篩選抗體庫(kù)的主流方法，其中使用最廣泛的是基于絲狀噬菌體表面的抗體展示。將抗體基因與外殼蛋白基因連接并融合表達(dá)，使抗體蛋白成為噬菌體外殼蛋白的一部分，陽(yáng)性克隆與固定抗原結(jié)合，其他噬菌體被洗去，洗脫后再重復(fù)該過(guò)程，以達(dá)到富集的目的（圖2）。3～6 輪后感染合適的細(xì)菌，以便收集噬菌粒，獲得DNA序列并測(cè)序，以鑒定具有親和性的抗體。噬菌體展示可直接得到抗體基因并高選擇性地篩選抗體，但易受轉(zhuǎn)化效率限制。

也可在微生物細(xì)胞表面展示抗體，如大腸桿菌和釀酒酵母［14］。以大腸桿菌為例，將抗體基因插入大腸桿菌外膜蛋白基因，使抗體蛋白進(jìn)入重組細(xì)胞外表面并展示在外膜蛋白上，但不能展示過(guò)大的蛋白?？贵w庫(kù)的每個(gè)細(xì)胞展示不同抗體的多個(gè)拷貝，將抗體庫(kù)與熒光標(biāo)記的抗原共孵育以達(dá)到篩選目的。能與抗原結(jié)合的細(xì)胞被熒光標(biāo)記，通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選（Fluo?rescence?activated cell sorting，F(xiàn)ACS）分離。

圖2 噬菌體展示流程Figure 2 General protocol of phage display

核糖體展示需要核糖體、mRNA 和抗體形成三元復(fù)合物，通過(guò)加工修飾DNA，使核糖體翻譯到mRNA末端時(shí)缺乏終止密碼子而不脫離，形成三元復(fù)合物。復(fù)合物的mRNA 被反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生編碼抗體的DNA，抗體負(fù)責(zé)與固定化抗原結(jié)合。然后DNA 被RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄，開(kāi)始另一個(gè)形成和篩選三元復(fù)合物的循環(huán)。也可以直接通過(guò)活性氨基酸類似物嘌呤霉素形成共價(jià)的mRNA?抗體復(fù)合物，優(yōu)點(diǎn)是共價(jià)mRNA?抗體復(fù)合物更穩(wěn)定，可以在嚴(yán)格的篩選條件下富集抗體并增強(qiáng)穩(wěn)定性。核糖體展示不受細(xì)胞轉(zhuǎn)染和表達(dá)影響，但操作過(guò)程較復(fù)雜。

不同的淘選策略決定了最終的結(jié)果，例如淘選中使用的洗脫方法會(huì)影響抗體的結(jié)合特性，但有效的策略在實(shí)驗(yàn)前是很難預(yù)測(cè)的［15］。多種方式組合的淘選策略可能比單一的方法效果更好，有研究稱噬菌體展示、酵母展示和FACS結(jié)合的篩選方法廣泛適用于分離可溶性抗原的scfv［16］。抗體庫(kù)的篩選是抗體工程最重要的工具之一。篩選大容量抗體庫(kù)的能力使模擬哺乳動(dòng)物免疫反應(yīng)的技術(shù)得以發(fā)展，無(wú)需動(dòng)物免疫即可分離抗體，并改造出具有更高親和力、穩(wěn)定性、效應(yīng)子功能的抗體。

3 基因工程抗體在識(shí)別小分子中的應(yīng)用

常見(jiàn)的小分子類別包括農(nóng)藥、除草劑、殺蟲(chóng)劑、藥物、維生素、類固醇、激素、炸藥、染料、毒素和代謝物等。還有一些是生物學(xué)研究中常用的試劑，如熒光素、生物素、地高辛和二硝基酚［17］。因此識(shí)別小分子的基因工程抗體大多應(yīng)用于食品、環(huán)境污染物檢測(cè)，醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)及免疫療法中［18］。

3.1 食品和環(huán)境污染物檢測(cè)

基因工程抗體已經(jīng)較多應(yīng)用到食品和環(huán)境污染物檢測(cè)中，表現(xiàn)出良好的靈敏度和特異性。殺蟲(chóng)劑、多氯聯(lián)苯、生物毒素、多環(huán)芳烴和金屬等低分子量污染物的特異性抗體對(duì)食品、水源、生態(tài)系統(tǒng)安全至關(guān)重要［16］。霉菌毒素不僅污染食品，還會(huì)危害人體健康，如黃曲霉毒素B1［19］和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇［20］致癌，貝類毒素和微囊藻毒素［21］等海洋毒素也是研究熱點(diǎn)。食品中的另一類主要污染源來(lái)自農(nóng)藥、除草劑和殺菌劑，如莠去津［22］，這類物質(zhì)也是環(huán)境污染物之一。其他由于濫用或殘留而易造成污染的物質(zhì)有維生素、抗生素［23］、抗菌素［15］、藥物［24］，經(jīng)過(guò)治療的動(dòng)物的肉和牛奶中可能會(huì)有殘留［25］。此外，環(huán)境中的污染物還涉及工業(yè)相關(guān)的石油、阻燃劑、炸藥等（表1）。

值得注意的是，這些研究開(kāi)發(fā)的免疫分析系統(tǒng)針對(duì)的分析物雖然不同，但研發(fā)的目的與方向卻是一致的：一是用非競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定或其他更優(yōu)的免疫測(cè)定法代替競(jìng)爭(zhēng)法；二是提高其廣譜特異性，這對(duì)實(shí)現(xiàn)快速、方便、準(zhǔn)確的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)十分重要，也對(duì)抗體的特異性提出了更高的要求?；诳贵w重鏈和輕鏈結(jié)合的開(kāi)放夾心免疫分析（Open?sandwich immunoassay，OS?IA）只需要單個(gè)抗體就能快速非競(jìng)爭(zhēng)地均相檢測(cè)小分子，然而這種免疫分析方法更青睞scFv 和Fab。雖然sdAb在檢測(cè)小分子中也有應(yīng)用，且在與小分子結(jié)合過(guò)程中，VH 的作用似乎比VL 重要，但由于缺乏常規(guī)抗體的重鏈?輕鏈結(jié)構(gòu)域，所以不容易結(jié)合小分子，成功的例子很少［26］。

3.2 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與免疫治療

針對(duì)小分子的抗體可用于體外快速診斷［21］、濫用藥物診斷、毒品檢測(cè)（表2），不限于傳統(tǒng)診斷和藥物檢測(cè)所用的血清，可直接測(cè)定人的唾液、尿液、排泄物等。Immunalysis公司的毒品尿檢試劑盒使用了抗6?乙酰嗎啡的Fab，能特異性識(shí)別6?乙酰嗎啡而與分子結(jié)構(gòu)上只差一個(gè)醛基的嗎啡沒(méi)有交叉反應(yīng)［27］。完整抗體相對(duì)較大的體積和較長(zhǎng)的血清半衰期不利于腫瘤的深層滲透，對(duì)放射敏感性組織（如骨髓）的高輻射劑量也一直是個(gè)問(wèn)題。為了獲得較高的腫瘤特異性信號(hào)和治療功效，在靶向藥物遞送過(guò)程中需要提高腫瘤對(duì)背景的比率［28］。除了直接靶向蛋白抗原，基因工程抗體與小分子的結(jié)合為腫瘤治療、基因治療、蛋白替代療法提供了新的思路。

表1 用于檢測(cè)食品和環(huán)境污染物的基因工程抗體Table 1 Genetically engineered antibodies prepared for detection of food and environmental contaminants

表2 用于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與免疫治療的基因工程抗體Table 2 Genetically engineered antibodies prepared for medical examination and immunotherapy

4 討論與展望

與傳統(tǒng)抗體相比，基因工程抗體在識(shí)別小分子方面的優(yōu)勢(shì)十分明顯。雖然通過(guò)傳統(tǒng)免疫方法已獲得具有特異性的小分子單克隆抗體和多克隆抗體，但多抗的功能在不同免疫批次之間可能會(huì)有所不同，生產(chǎn)單抗的雜交瘤細(xì)胞系也可能不夠穩(wěn)定［29］，其親和力和特異性遠(yuǎn)不如基因工程抗體。結(jié)合體外展示技術(shù)，通過(guò)控制篩選條件，基因工程抗體能夠識(shí)別相關(guān)小分子間的細(xì)微差異，如甲基化、磷酸化等化學(xué)修飾、蛋白質(zhì)序列和特定的構(gòu)象，其效果好于通過(guò)免疫獲得的抗體。盡管抗體庫(kù)技術(shù)還沒(méi)有完全取代傳統(tǒng)方法，但通過(guò)體外展示篩選出的基因工程抗體能快速獲得抗體序列信息，更好地控制抗體的性質(zhì)，有利于在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究中的應(yīng)用［30］?；蚬こ炭贵w還克服了免疫耐受性，可選擇識(shí)別高度保守的靶標(biāo)的親和試劑，對(duì)化學(xué)或熱變性有更高抗性［12］。在技術(shù)層面，基因工程抗體的體外展示相對(duì)簡(jiǎn)單、廉價(jià)、快速，易于自動(dòng)化以提高篩選效率［31］。

在制備基因工程抗體時(shí)，小分子與載體分子結(jié)合作為抗原，具有高溶解度和易于固定的優(yōu)點(diǎn)，但也可能會(huì)改變小分子的抗原性。將兩種性激素尿液代謝物分別與BSA偶聯(lián)時(shí)，發(fā)現(xiàn)小分子本身的活性基團(tuán)、不飽和立體結(jié)構(gòu)等對(duì)產(chǎn)生抗體的特異性存在一定影響。此外，體外展示通常會(huì)產(chǎn)生針對(duì)免疫優(yōu)勢(shì)表位的抗體片段，而當(dāng)小分子的表位較弱時(shí)，則不會(huì)或很少產(chǎn)生針對(duì)小分子的抗體。可將小分子直接與固相載體結(jié)合，針對(duì)固定的小分子篩選抗體來(lái)避免這個(gè)問(wèn)題。雖然理想目標(biāo)是抗體對(duì)靶分子獨(dú)具高特異性，但也有可能會(huì)出現(xiàn)僅識(shí)別小分子?載體加合物和載體蛋白而不能單獨(dú)識(shí)別小分子的情況，最有效且直接的方法是在淘選階段改變載體蛋白［32］。雖然原理上將抗體庫(kù)與過(guò)量的載體蛋白共孵育也能去除與載體蛋白結(jié)合的抗體［22］，但在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，判斷載體蛋白是否過(guò)量十分困難，且需要控制加入的抗體庫(kù)的量，這種間接競(jìng)爭(zhēng)的方法無(wú)法完全去除非陽(yáng)性克隆。

出于檢測(cè)的目的，基因工程抗體需要具備識(shí)別小分子與其結(jié)構(gòu)類似物的能力。雖然通過(guò)抗體庫(kù)技術(shù)可以產(chǎn)生滿足這類要求的抗體，但僅通過(guò)展示技術(shù)無(wú)法直接將其篩選出來(lái)。目前的鑒定方法一般以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（Enzyme?linked immunosorbent assay，ELISA）為主，不僅要測(cè)定抗體識(shí)別小分子的親和力，還需測(cè)定抗體與其他相似小分子的交叉反應(yīng)率以判斷特異性，通常需要分析上千個(gè)克隆才能得到親和力和特異性都滿足產(chǎn)品要求的抗體，巨大的工作量也成為基因工程抗體識(shí)別小分子應(yīng)用中的阻礙。其他不利因素還包括許多小分子的標(biāo)準(zhǔn)品難以獲得或價(jià)格昂貴，增加了制備基因工程抗體的成本。開(kāi)發(fā)免疫測(cè)定產(chǎn)品的趨勢(shì)之一是開(kāi)發(fā)類別特異性檢測(cè)法或多種分析物測(cè)定法，一次測(cè)試即可測(cè)定多個(gè)目標(biāo)。針對(duì)小分子的分析測(cè)定和診斷方法種類繁多，除了最常見(jiàn)的高效液相色譜法、ELISA、放射免疫分析之外，還有基于表面等離子共振的抑制免疫分析、OS?IA、雙抗體夾心ELISA、間接競(jìng)爭(zhēng)性噬菌體ELISA、免疫PCR 等。不同的檢測(cè)方法對(duì)抗體的要求不同，在制備識(shí)別小分子的基因工程抗體時(shí)，也必須選擇合適的檢測(cè)方法。