暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的分子鑒定及母種培養(yǎng)基篩選

張冰冰，張國珍，樊莉娟，王 菲，秦小波，，徐 鶯

（1.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610065；2.四川省自然資源科學(xué)研究院，成都610015）

暗褐網(wǎng)柄牛肝菌（Phlebopus portentosus）隸屬于牛肝菌目（Boletales）小牛肝菌科（Boletaceae）網(wǎng)柄牛肝菌屬（Phlebopus），主要分布于熱帶地區(qū)，中國主要分布在四川、云南、廣西、海南等地［1］。牛肝菌目食用菌營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨特，深受消費者喜愛，市場消費前景好［2］。但是，目前實現(xiàn)人工栽培的牛肝菌目種類還只有暗褐網(wǎng)柄牛肝菌，其栽培模式是利用組織分離法［3］從子實體上獲得母種菌絲，進(jìn)而繁育出原種、栽培種，最終獲得商業(yè)化子實體。因此，優(yōu)質(zhì)母種菌絲是獲得優(yōu)質(zhì)子實體的基礎(chǔ)。研究表明母種菌絲的長勢會隨著繼代次數(shù)的增加而減弱，需要適合的母種培養(yǎng)基予以維持［4?5］。本研究在對收集的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌進(jìn)行分子鑒定的基礎(chǔ)上，對分離出的菌絲生長所需的氮源、氮源濃度、無機(jī)鹽和維生素B1 進(jìn)行了優(yōu)化探究，以期為暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的人工栽培技術(shù)的發(fā)展提供實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生牛肝菌樣品采集于中國西南地區(qū)，通過組織分離法獲得純化菌株。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

參照張春霞等［6］的描述對其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.2 基于rDNA ITS序列分析的分子鑒定

采用DNA 提取試劑盒（天根生化北京有限公司）進(jìn)行提取子實體DNA 為模板，利用rDNA ITS 通用引物ITS1（5'?TCCGTAGGTGAACCTGCGG?3'）與ITS4（5'?TCCTCCGCTTATTGATATGC?3'）（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)使用2×TSING Master Mix體系（擎科生物技術(shù)有限公司），在BIO?RAD T100TM Thermal Cycler PCR 儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，34 個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，12 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收目的條帶連接至T4 Quick Blunt 載體，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序后，采用BLAST 工具在NCBI 核酸數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性比較分析。

1.2.3 氮源篩選

以PDA 培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基［6］，分別加入2 g/L酵母膏、2 g/L 牛肉膏、0.5 g/L NH4Cl、0.5 g/L NH4NO3進(jìn)行氮源篩選。用6 mm 打孔器取菌塊接種于供試培養(yǎng)基中央，每皿1 塊，25 ℃恒溫箱暗培養(yǎng)14 d，十字交叉法測量菌落直徑。每個處理3個重復(fù)。

1.2.4 氮源濃度的優(yōu)化

對篩選出的最適氮源分別取0.5、1.0和1.5 g/L等3個質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化篩選，培養(yǎng)條件和菌落直徑測量方法同上。

1.2.5 維生素B1對暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲生長的影響

在含不同氮源（2.0 g/L 酵母膏、2.0 g/L 牛肉膏、0.5 g/L NH4Cl、30.5 g/L NH4NO3）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，設(shè)置空白對照組與0.05 g/L 維生素B1組，進(jìn)行對菌絲培養(yǎng)效果比較，重復(fù)3 次，培養(yǎng)條件和菌落直徑測量方法同上。

1.2.6 無機(jī)鹽篩選

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入1.0 g/L MgSO4、1.0 g/L KH2PO4作為對照，用1.0 g/L MgCl2、1.0 g/L KCl 代替對照培養(yǎng)基的MgSO4／KH2PO4作為處理組，每個處理3個重復(fù)，培養(yǎng)條件和菌落直徑測量方法同上。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計用SPASS 22.0軟件采用ANOVA 方法完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

供試樣品呈擔(dān)子果肉質(zhì)，菌蓋直徑6.75～8.44 cm，表面平滑，無光澤、無黏液，中凹，黑褐色；菌肉有微酸味，松軟，海綿質(zhì)，淡黃色；菌管髓菌絲平行列，孔口圓形；菌柄長6.44～8.46 cm，直徑3.0～4.5 cm，中生，近柱形，暗褐色，表面具網(wǎng)紋，基部膨大。在顯微鏡下觀察孢子，呈深黃色，短橢圓形，擔(dān)子呈長棒狀（圖1）。觀察發(fā)現(xiàn)，供試樣品無論子實體形態(tài)還是孢子特征均符合胡生華等［5］對網(wǎng)柄牛肝菌屬的記載，初步鑒定樣品隸屬于網(wǎng)柄牛肝菌屬。

圖1 供試牛肝菌樣品的形態(tài)學(xué)鑒定Figure 1 Morphological identification of boletus samples

2.2 基于ITS序列的分子鑒定

使用真菌通用引物ITS1 和ITS4 對供試牛肝菌樣品的ITS 序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得長度為750～1 000 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物（圖2）。經(jīng)克隆測序后發(fā)現(xiàn)，供試牛肝菌子實體樣品的rDNA ITS 序列分為兩個長度：790 bp 和793 bp（表1）。將所獲序列與GenBank 核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列相似性檢索，皆與GenBank 中暗褐網(wǎng)柄牛肝菌ITS 序列（JQ695905.1）相似性程度達(dá)到99%，說明所獲樣品均屬于暗褐網(wǎng)柄牛肝菌。

圖2 各樣品rDNA ITS區(qū)段PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Figure 2 Phlebopus portentosus rDNA ITS amplification patterns

表1 ITS序列比對及種屬鑒定Table 1 ITS sequence alignment and species identification

2.3 菌絲體培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 氮源的篩選

氮源是真菌合成蛋白質(zhì)、核酸的必要原料，對菌絲的生長發(fā)育至關(guān)重要。暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲在供試的4 種氮源培養(yǎng)基中生長差異較大（圖3）。從菌落直徑來看，從大到小依次為：氯化銨培養(yǎng)基、牛肉膏培養(yǎng)基、硝酸銨培養(yǎng)基和酵母膏培養(yǎng)基。前兩者顯著大于酵母膏培養(yǎng)基，并且兩者之間的差異也達(dá)到顯著水平，但硝酸銨和酵母膏的差異未達(dá)到顯著水平；從菌落形態(tài)來看，酵母膏和牛肉膏培養(yǎng)基菌落顏色呈灰褐色，略深于氯化銨和硝酸銨培養(yǎng)基菌落的黃褐色；酵母膏和牛肉膏培養(yǎng)基的菌絲也較氯化銨和硝酸銨培養(yǎng)基菌絲粗壯；酵母膏培養(yǎng)基和硝酸銨培養(yǎng)基的菌落直徑較為整齊，牛肉膏培養(yǎng)基和氯化銨培養(yǎng)基次之。

圖3 不同氮源對菌絲生長的影響Figure 3 Effect of different nitrogen sources on the growth of mycelium

2.3.2 氮源濃度的優(yōu)化

氯化銨的濃度對暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲生長也有明顯影響，但主要體現(xiàn)在菌絲形態(tài)上（圖4）。在不同濃度處理下的菌落直徑差異均未達(dá)到極顯著差異，僅含1.5 g/L 氯化銨的培養(yǎng)基上的菌落直徑與前兩者相比有顯著性下降，但減少幅度也僅為3%～5%（圖4）。但是，在形態(tài)方面，含0.5 g/L 氯化銨的培養(yǎng)基上生長的菌絲顏色最深，呈暗褐色，菌絲最為粗壯，菌落邊緣較為整齊。含1.0 g/L氯化銨的培養(yǎng)基菌絲顏色最淺，呈潔白色，菌絲纖弱，菌落邊緣不整齊。含1.5 g/L 氯化銨的培養(yǎng)基顏色較淺，呈淺褐色，菌絲粗壯程度僅次于0.5 g/L，菌落邊緣卻最整齊。因此，在本次實驗中0.5 g/L的氯化銨更利于暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲生長。

圖4 氯化銨濃度對菌絲生長的影響Figure 4 Effect of ammonium chloride concentration on the growth of mycelium

2.3.3 維生素B1對菌絲生長的影響

維生素B1 對暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲生長是否存在影響與氮源類型有關(guān)（圖5）。在以酵母膏、牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基中，維生素B1的加入對菌落直徑無顯著影響。但在以氯化銨為氮源的培養(yǎng)基中，維生素B1的加入抑制了菌絲的生長，在以硝酸銨為氮源的培養(yǎng)基中情況則正好相反，維生素B1的加入促進(jìn)了菌絲的生長，菌落直徑的差異達(dá)到顯著。從菌落形態(tài)來看：維生素B1 與酵母膏、牛肉膏和硝酸銨等3 種氮源結(jié)合的培養(yǎng)基菌落顏色較深呈灰褐色，與氯化銨結(jié)合的培養(yǎng)基菌落顏色較淺呈黃褐色，菌絲粗壯程度與菌落顏色呈現(xiàn)相同；除維生素B1與酵母膏結(jié)合的培養(yǎng)基菌落邊緣較為整齊外，其他培養(yǎng)基菌落邊緣均不整齊。

圖5 維生素B1對暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲生長的影響Figure 5 Effect of vitamin B1 on the growth of mycelium

2.3.4 不同無機(jī)鹽對菌絲生長的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加MgSO4/KH2PO4和MgCl2/KCl兩種組合的無機(jī)鹽，發(fā)現(xiàn)兩種培養(yǎng)基上的菌落直徑均未達(dá)到顯著差異水平（圖6），且兩種培養(yǎng)基的菌落形態(tài)較為相似，菌落顏色均呈暗褐色，且菌落邊緣較為整齊，菌落較為致密。

圖6 不同的無機(jī)鹽對菌絲生長的影響Figure 6 Effects of different inorganic salts on the growth of hypha

3 討論與結(jié)論

良好的培養(yǎng)基是獲得優(yōu)質(zhì)菌絲的前提。張春霞等［6］認(rèn)為生長良好的暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲應(yīng)具有直徑大、菌絲呈暗褐色、菌落邊緣整齊、菌絲粗壯等特征。因此，本實驗從這4個方面出發(fā)評價培養(yǎng)基的優(yōu)劣。

不同于以往的研究［7］，本實驗得出暗褐網(wǎng)柄牛肝菌的最適氮源為氯化銨。相較于有機(jī)氮源如酵母膏、牛肉膏等，氯化銨的成分簡單，可被菌絲體快速利用。

一般而言，微生物在早期傾向于利用無機(jī)氮源，中期微生物的代謝酶系已經(jīng)建立，微生物對有機(jī)氮源的利用率提高。因此，培養(yǎng)時間在一定程度上也影響了微生物對氮源的利用。本次氮源篩選試驗菌絲培養(yǎng)僅14 d，較其他研究培養(yǎng)時間較短，這可能是氯化銨較其他氮源更能促進(jìn)菌絲生長的原因。另外，多篇報道顯示牛肝菌的適宜氮源為氯化銨，如點柄粘蓋牛肝菌［8］、厚環(huán)乳牛肝菌［9］等。相較于氯化銨，本次實驗硝酸銨對菌絲生長的促進(jìn)作用較弱，可能是菌絲對NO-3的利用效率較低導(dǎo)致。NO-3在利用氮源時需要經(jīng)過硝酸還原酶和亞硝酸還原酶的作用［10］，而NH+4則不需要。具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

維生素B1 是大型真菌中酶進(jìn)行多種生命活動時的重要成分，對菌絲生長主要起促進(jìn)作用。目前，大多數(shù)研究還集中在探究單一維生素種類對真菌生長的影響［11?13］，很少分析維生素和其他營養(yǎng)元素結(jié)合時對菌絲生長的影響。本實驗發(fā)現(xiàn)維生素B1 在和不同氮源結(jié)合時對暗褐網(wǎng)柄牛肝菌菌絲生長的影響差異顯著，與酵母膏、牛肉膏、氯化銨結(jié)合時不促進(jìn)菌絲生長，與硝酸銨結(jié)合時顯著促進(jìn)菌絲生長，這可能是因為菌絲在無維生素B1 的添加或添加量較少時就能對前3 種氮源完全利用的緣故。這也暗示在日后的實際應(yīng)用中應(yīng)注意加入培養(yǎng)基營養(yǎng)元素的種類，考慮是否加入維生素作為輔助，避免適得其反的效果。

本次還對無機(jī)鹽對菌絲生長的影響進(jìn)行了探究，選取MgSO4／KH2PO4和MgCl2／KCl 互為對照，結(jié)果表明，兩種無機(jī)鹽組合無論在菌落直徑還是菌落形態(tài)上差異都不顯著。從節(jié)約生產(chǎn)成本的角度出發(fā)，建議以價格相對低廉的MgCl2／KCl 作為無機(jī)鹽進(jìn)行菌絲培養(yǎng)較為適宜。