石墨烯量子點(diǎn)提高DNAzyme在細(xì)胞水平上的穩(wěn)定性

黃奇萍，劉 慧，張井巖，鄭 靜

（1.華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海200237）

自1994 年首次發(fā)現(xiàn)Pb2+依賴性切割RNA 的單鏈DNA 片段（又稱脫氧核糖核酸酶或者DNAzyme）至今，科學(xué)家相繼發(fā)現(xiàn)了更多具有不同催化功能的DNA?zyme［1?2］。目前發(fā)現(xiàn)DNAzyme 的催化功能包括：斷裂和連接RNA、磷酸化DNA、氧化DNA 等。其中，催化RNA 斷裂的DNAzyme 因?yàn)槠錆撛诘膽?yīng)用價(jià)值而備受關(guān)注，10?23 DNAzyme 是其中研究最為廣泛的斷裂RNA 的DNAzyme 之一［3?4］。10?23 DNAzyme 是體外循環(huán)中第10輪循環(huán)的第23個(gè)克隆，由一個(gè)催化核心區(qū)域和兩側(cè)的底物結(jié)合區(qū)域組成，結(jié)合區(qū)域由DNAzyme 左右兩端7～9 個(gè)和底物互補(bǔ)配對(duì)的脫氧核苷酸組成，催化核心區(qū)域由和底物未完全互補(bǔ)配對(duì)的15 個(gè)脫氧核苷酸組成。只要改變10?23 DNAzyme 結(jié)合區(qū)域中的堿基序列就可作用于不同的RNA 底物［5?6］。Cairns 等［7］根據(jù)10?23 DNAzyme 設(shè)計(jì)了80 多個(gè)靶向HPV?16 的E6、E7 mRNA 的DNAzyme 以及60 多個(gè)針 對(duì)大鼠c?myc 基因的DNAzyme，其中8 種DNAzyme 對(duì)HPV?16 致癌基因有高效的切割效率。Sun等［8］研究發(fā)現(xiàn)，在適宜的體外條件下，10?23 DNAzyme 對(duì)c?myc mRNA 的AU位 點(diǎn) 切 割 效 率 高 達(dá)20%～50%。Zhang 等［9］將靶向VEGRF?2的10?23 DNAzyme 注入到移植了腫瘤的無(wú)胸腺裸鼠體內(nèi)后，裸鼠腫瘤生長(zhǎng)得到明顯的抑制。與對(duì)照組（注射生理鹽水）相比，注射4 次DNAzyme 后的裸鼠腫瘤體積縮小近75%，且腫瘤外區(qū)域細(xì)胞死亡顯著增加。由此可見，10?23 DNAzyme 作為一個(gè)潛在RNA切割工具具有很好的應(yīng)用前景，唯一不足的是它在細(xì)胞水平的穩(wěn)定性較差。

石墨烯量子點(diǎn)（GQDs）具有單層碳原子，尺寸較小，邊緣具有羧基官能團(tuán)，而且具有低細(xì)胞毒性［10］、良好的水溶性、化學(xué)惰性［11］等性質(zhì)，所以在負(fù)載藥物和DNA方面已顯示出優(yōu)良的應(yīng)用前景［12］。Zhang 等［13］將GQDs用于干細(xì)胞標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)GQDs 比較容易進(jìn)入細(xì)胞，且表現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性，可以產(chǎn)生清晰穩(wěn)定的圖像。利用GQDs可以與多種分子結(jié)合的性質(zhì)，Wang等［14］用粒度為15 nm 的PEG 對(duì)GQDs進(jìn)行表面修飾，利用氫鍵將阿霉素（DOX）結(jié)合到GQDs 表面形成DOX@GQDs?PEG。GQDs?PEG 作為藥物載體，運(yùn)載能力可以達(dá)到2.5 mg／mg，可以通過(guò)調(diào)節(jié)pH 值控制其對(duì)藥物的釋放。Sui等［15］發(fā)現(xiàn)GQDs與順鉑（CDDP）結(jié)合后，由順鉑導(dǎo)致的細(xì)胞毒性增大，細(xì)胞周期停滯以及DNA 分裂程度加強(qiáng)。GQDs 通過(guò)提高細(xì)胞通透性來(lái)增加其細(xì)胞攝取量，在細(xì)胞內(nèi)增強(qiáng)其與DNA 的相互作用，從而改善CDDP的藥物性能。這說(shuō)明GDQs可以通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞攝取藥物能力來(lái)提高抗腫瘤藥物的化療效果。

為了提高DNAzyme 在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，選用兩個(gè)靶向TNF?α基因的DNAzyme與GQDs 結(jié)合。雖然目前已有多種抑制TNF?α 蛋白表達(dá)的方法，包括利用靶向TNF?α 的siRNA［16］，但是siRNA 的轉(zhuǎn)入一般比較繁瑣［17］，而且由于siRNA 的穩(wěn)定性差，所以最終效率比較低。本文系統(tǒng)研究以GQDs 為載體的復(fù)合體系在細(xì)胞水平的穩(wěn)定性以及它們抑制TNF?α 蛋白表達(dá)的能力。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人宮頸癌細(xì)胞系Hela 和人乳腺癌細(xì)胞MCF?7 細(xì)胞均購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。培育Hela 使用的DMEM 培養(yǎng)基和培養(yǎng)MCF?7使用的RPMI?1640培養(yǎng)基均補(bǔ)充添加10%加強(qiáng)型新生牛血清以及1%青霉素?鏈霉素雙抗溶液。細(xì)胞于37 ℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。DMEM 培養(yǎng)基和RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；青霉素鏈霉素雙抗溶液和Hoechst 33258 購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)自Solar?bio公司。GAPDH和二抗（goat?anti?rabbit）購(gòu)自Protein?tech公司。GQDs由上海交通大學(xué)微納米科學(xué)科技研究院郭守武教授課題組提供。實(shí)驗(yàn)所用核苷酸序列是根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)的［20?21］，均由上海生工生物工程有限公司合成，經(jīng)UltraPAGE純化。具體序列如下：

TNF?DNAzyme1：5’?FAM?GTGCTCAGGCTAGCTAC AACGAGGTGTCC?dT?3'

TNF?DNAzyme2：5'?FAM?GCAGAAGAGGGCTAGCTAC AACGAGTGGTGGCG?dT?3'

Substrate1：5'?GGACACCrArUGAGCAC?3'

Substrate2：5'?CGCCACCACrArUTCTTCTGC?3'

Cu?DNAzyme：5'?TGAGTGAGTCTGGGCCTCTTTTTAA GAAC?3'

Substrate for Cu?DNAzyme：5'?GAATTCTAATACGACTC AGCCG?FAM?3'

1.2 測(cè)試和表征

熒光分光光度計(jì)（中國(guó)Angilent Technologies 公司Cary Eclipse）；化學(xué)發(fā)光儀（中國(guó)天能公司Tanon 5200S）；垂直電泳槽（中國(guó)北京六一儀器廠Mini?Protean Tetra）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司Synergy 2）。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 GQDs和單雙鏈DNA（sDNA／dsDNA）的相互作用

末端熒光標(biāo)記的sDNA 退火后，與一定濃度的GQDs 混合均勻，通過(guò)檢測(cè)體系熒光強(qiáng)度變化來(lái)考察GQDs 和sDNA 的相互作用。同樣，通過(guò)檢測(cè)部分互補(bǔ)配對(duì)的DNAzyme?底物體系與不同濃度的GQDs相互作用后的熒光強(qiáng)度來(lái)考察GQDs 與雙鏈DNA 的相互作用。為了驗(yàn)證被GQDs 吸附之后的DNAzyme 仍具有活性，以課題組前期研究的銅離子依賴性DNAzyme 為對(duì)象進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［22］。銅離子依賴性DNAzyme（E）和熒光標(biāo)記底物（S）1∶1混合后高溫退火，加入GQDs和28 μmol／L輔助因子，37 ℃恒溫水浴反應(yīng)30 min，用熒光分光光度計(jì)（激發(fā)波長(zhǎng)，495 nm）檢測(cè)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度。

1.3.2 TNF?DNAzyme體外活性檢測(cè)

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)TNF?DNAzyme1 的體外活性。若TNF?DNAzyme1 具有活性，其能夠在金屬輔助因子Mg2+存在下有效切割底物。TNF?DNA?zyme1／Substrate1 復(fù)合體系高溫退火后配置20 μL 的反應(yīng)體系（含2 μL 20 μmol／L 的酶和底物復(fù)合溶液，16 μL Tris?HCl 溶液，2 μL 200 mmol／L Mg2+），37 ℃恒溫反應(yīng)30 min；反應(yīng)結(jié)束后加入4 μL 電泳上樣緩沖液（8 mol／L 尿素，0.3 mol／L 蔗糖，50 mmol／L 乙二胺四乙酸二鈉，5 mmol／L Tris?硼酸溶液，pH 8.3），混合均勻，離心，80 ℃金屬浴中加熱5 min 后立即放入冰盒，等待上樣；28%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離DNA 序列。底物切割效率計(jì)算公式：P=1-Sr／St，其中Sr代表底物剩余的量，St代表反應(yīng)前底物的總量。

1.3.3 細(xì)胞中總蛋白的提取

Hela細(xì)胞以4×105mL-1的密度接種于6孔板中，貼壁后用含有20 mmol／L Mg2+的培養(yǎng)基預(yù)處理60 min，PBS 充分洗滌，加入2 mL 含有TNF?DNAzyme1／GQDs的培養(yǎng)基。其中GQDs 濃度為50 μg／mL，TNF?DNA?zyme1 濃度為40 nmol／L。細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培育0、12、24、36 和48 h。對(duì)于含有TNF?DNAzyme2，或者GQDs 等體系實(shí)驗(yàn)操作同上。細(xì)胞培育結(jié)束后，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。

1.3.4 BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度

800 μL 蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液加入到蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（20 mg BSA）中，充分混合，配成25 mg／mL 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液；取蛋白標(biāo)準(zhǔn)液適量，稀釋至濃度為5 mg／mL；按體積比50∶1 混合BCA 試劑盒A 液B 液制成BCA 工作液；將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12 和16 μL 加到96 孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，每個(gè)孔用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足至20 μL；用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將待測(cè)蛋白稀釋至適當(dāng)濃度，取20 μL 樣品，加到96 孔板的樣品孔中；每孔加入200 μL BCA 工作液，37 ℃反應(yīng)30 min；酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品在562 nm 處的吸收值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品的蛋白濃度。

1.3.5 Western Blot

Western Blot 檢測(cè)Hela 細(xì)胞中TNF?a 蛋白的表達(dá)水平。蛋白上樣量為10 μg，恒定電壓80 V 經(jīng)分離膠電脈20 min 后，調(diào)整電壓為120 V，直至上樣緩沖液中的藍(lán)色條帶到達(dá)膠的底部；用200 mA 恒定電流轉(zhuǎn)膜；TBST洗滌PVDF膜4×10 min；PVDF膜用5%的脫脂牛奶封閉1 h；4 ℃下用一抗孵育過(guò)夜；TBST 洗滌2×10 min；再用二抗常溫孵育1 h。利用超敏ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果。

1.3.6 細(xì)胞毒性檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Hela 細(xì)胞接種于96 孔板，每孔100 μL，常規(guī)培養(yǎng)12 h 后加入含20 mmol／L Mg2+的培養(yǎng)基預(yù)處理60 min；結(jié)束后用PBS 清洗2 次；細(xì)胞中加入分別含有TNF?DNAzyme1、TNF?DNAzyme2、TNF?DNAzyme1／GQDs、TNF?DNAzyme2／GQDs 和GQDs的同體積培養(yǎng)基，在37 ℃、5 % CO2、飽和濕度下培育36 h。每組設(shè)5個(gè)平行復(fù)孔，另設(shè)相同平行復(fù)孔的空白組、對(duì)照組。結(jié)束培育后，PBS 充分洗滌，加入100 μL MTT 繼續(xù)培養(yǎng)4 h；加入150 μL DMSO，輕微搖蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞在570 nm處的吸光度值A(chǔ)。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組A值／對(duì)照組A值）×100%。

2 結(jié)果和討論

2.1 GQDs的表征

實(shí)驗(yàn)用的GQDs是單層石墨烯量子點(diǎn)，其熒光強(qiáng)度較弱，在細(xì)胞中很難直接觀察到其熒光［18］。為了確認(rèn)作為載體GQDs 能否進(jìn)入細(xì)胞，利用GQDs 可以淬滅小分子的熒光的特性，首先將細(xì)胞用Hoechst染色，細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色Hoechst熒光；利用GQDs可以有效淬滅小分子熒光的特點(diǎn)，將染色后的細(xì)胞與GQDs共培育，跟蹤GQDs是否進(jìn)入細(xì)胞。如圖1所示，隨著GQDs濃度的增加，共培育時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞核內(nèi)的Hoechst可以被GQDs完全淬滅，表明GQDs能夠進(jìn)入到細(xì)胞核［19］。因此，GQDs具備作為DNAzyme載體的基本能力。

2.2 DNAzyme／GQDs體系的構(gòu)建

利用6'?FAM 標(biāo)記的單雙鏈DNA 的熒光強(qiáng)度變化來(lái)檢測(cè)GQDs 負(fù)載單雙鏈DNA 的能力［23］。如圖2（a）所示，隨著GQDs 濃度的增加，sDNA 的熒光強(qiáng)度隨之降低，當(dāng)GQDs濃度達(dá)到200 μg／mL時(shí)，體系中熒光強(qiáng)度基本為零。從圖2（b）可以看出，隨著體系中GQDs濃度不斷增加，檢測(cè)到DNAzyme?底物的雙鏈DNA（ES）的熒光強(qiáng)度越來(lái)越低。當(dāng)GQDs濃度達(dá)到500 μg／mL，體系中的熒光強(qiáng)度基本為零，說(shuō)明此時(shí)的ES 和GQDs 完全結(jié)合。由此可以初步確定，GQDs 能夠負(fù)載單鏈DNA以及DNAzyme?底物體系。

圖1 MCF?7細(xì)胞與Hoechst和Hoechst/GQDs分別共培育不同時(shí)間得到的熒光圖Figure 1 Fluorescence images of the MCF?7 cells after incubation with Hoechst and Hoechst/GQDs for different time

利用課題組前期研究的銅離子依賴性DNAzyme（Cu?DNAzyme），考察負(fù)載在GQDs 上DNAzyme 的活性［24］。如圖2（c）所示，GQDs 和ES 復(fù)合體系中加入輔助因子，37 ℃恒溫反應(yīng)30 min 后，僅檢測(cè)到微弱的熒光；但在體系中加入不同濃度的乙醇溶液后，體系的熒光信號(hào)增強(qiáng)。當(dāng)加入50%的乙醇時(shí)，熒光強(qiáng)度基本接近自由的ES 的熒光強(qiáng)度。由圖2（d）可知，被GQDs 吸附的ES體系在銅配合物存在下仍能表現(xiàn)出活性，但由于產(chǎn)物被GQDs 吸附，檢測(cè)到的熒光強(qiáng)度較低，當(dāng)有乙醇存在時(shí)，減弱了sDNA和GQDs之間的疏水作用，使得帶有熒光標(biāo)記的sDNA 游離到溶液中，熒光強(qiáng)度增加。為了確認(rèn)檢測(cè)到的熒光是來(lái)自熒光標(biāo)記的DNA 產(chǎn)物，在帶有熒光標(biāo)記的底物中加入足量的GQDs，后加入50%的乙醇溶液，充分混合后發(fā)現(xiàn)體系沒(méi)有熒光。同樣，ES體系也基本未被檢測(cè)到任何熒光信號(hào)。

2.3 TNF?DNAzyme1的體外活性

根據(jù)文獻(xiàn)［20］，以具有切割磷酸酯鍵能力的10?23 DNAzyme 為模版，設(shè)計(jì)合成了TNF?DNAzym1 和TNF?DNAzym2，具體見圖3（a）和3（b）。兩個(gè)DNA?zyme 具有和10?23 DNAzyme 相似的輔助因子鎂離子。首先考察鎂離子濃度對(duì)TNF?DNAzyme1 活性的影響，結(jié)果如圖3（c）所示。由圖3（d）可知：當(dāng)保持TNF?DNAzym1 和底物濃度保持不變時(shí)，隨著鎂離子濃度增加，TNF?DNAzyme1 切割活性逐漸增加。當(dāng)鎂離子濃度為50 mmol／L 時(shí)，切割效率高達(dá)60 %左右，且保持在穩(wěn)定的水平。在此條件下，反應(yīng)時(shí)間為30 min 時(shí)，TNF?DNAzyme1 活性達(dá)到最高，大約70 %的底物得到切割。TNF?DNAzyme1 活性與體系的pH 值也是相關(guān)的。由圖3（e）可知：在中性或偏堿性的環(huán)境中，TNF?DNAzyme1 活性達(dá)到最高；TNF?DNAzym2 的結(jié)構(gòu)與TNF?DNAzyme1 相似，但其在分子水平活性很低，有可能是因?yàn)樗姆€(wěn)定性較差。

圖2 熒光光譜法檢測(cè)GQDs和單鏈DNA（sDNA）Figure 2 The interaction between GQDs and sDNA and ES detected by the fluorescence change of the system

2.4 TNF?DNAzyme1／2對(duì)TNF?α蛋白表達(dá)的影響

TNF?DNAzyme1 或TNF?DNAzyme2 單獨(dú)與Hela 細(xì)胞作用48 h 后，細(xì)胞中TNF?a 蛋白的表達(dá)沒(méi)有明顯變化，結(jié)果如圖4（a）和4（b）所示。而以GQDs 為載體將TNF?DNAzyme1 導(dǎo)入到細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，隨著TNF?DNA?zyme1／GQDs 作用時(shí)間的加長(zhǎng)，Hela 細(xì)胞內(nèi)TNF?α 蛋白的表達(dá)量逐漸下降。當(dāng)作用36 h 后，TNF?DNA?zyme1／GQDs 體系對(duì)細(xì)胞的影響達(dá)到最大，蛋白的表達(dá)量降低了35%，見圖4（c）。

TNF?DNAzyme2／GQDs體系對(duì)TNF?α蛋白在細(xì)胞水平的表達(dá)影響更加顯著。如圖4（d）所示，隨著TNF?DNAzyme2／GQDs 與細(xì)胞共培育時(shí)間增長(zhǎng)，TNF?α 蛋白的表達(dá)量明顯下降。當(dāng)TNF?DNAzyme2／GQDs 與細(xì)胞作用36 h 后，細(xì)胞內(nèi)TNF?α 蛋白的表達(dá)量降低了近50%。值得注意的是，在同等條件下GQDs 單獨(dú)與細(xì)胞共培育后，TNF?α 蛋白表達(dá)量隨GQDs 濃度的升高而增大。當(dāng)GQDs 濃度為100 μg／mL 時(shí)，蛋白表達(dá)量達(dá)到最大，見圖4（g）。雖然目前還不知道GQDs 提高TNF?α表達(dá)的機(jī)理，但是可以肯定的是，這一結(jié)果表明TNF?DNAzyme／GQDs 體系對(duì)TNF?α 蛋白表達(dá)的影響應(yīng)該比實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到的更為顯著。

圖3 鎂離子濃度、反應(yīng)時(shí)間和pH值對(duì)TNF?DNAzyme1活性的影響Figure 3 Effects of Mg2+concentration，reaction time and pH on the TNF?DNAzyme1 activity

圖4 TNF?DNAzyme1/2對(duì)TNF?α蛋白表達(dá)的影響Figure 4 Effects of TNF?DNAzyme1/2 on the expression of TNF?α

為進(jìn)一步確認(rèn)和優(yōu)化TNF?DNAzyme1／GQDs 和TNF?DNAzyme2／GQDs 體系對(duì)TNF?α 蛋白表達(dá)的影響，考察了不同濃度GQDs 對(duì)TNF?DNAzyme1 和TNF?DNAzyme2 活性的影響。從圖4（e）可以看出：增加GQDs 濃度的TNF?DNAzyme1 對(duì)細(xì)胞內(nèi)TNF?α 蛋白表達(dá)量只是略有影響；而TNF?DNAzyme2／GQDs 作用的細(xì)胞的TNF?α蛋白表達(dá)量隨GQDs濃度升高明顯降低，當(dāng)GQDs 濃度為100 μg／mL 時(shí)，TNF?α 蛋白表達(dá)量達(dá)到最低，只有原來(lái)的50%左右。GQDs濃度在200 μg／mL時(shí)，目的蛋白的表達(dá)量反而有小幅度的上升，這可能是高濃度的GQDs和細(xì)胞培育36 h后造成細(xì)胞凋亡，見圖4（f）?；诤蛦为?dú)TNF?DNAzyme，單獨(dú)GQDs 與細(xì)胞作用的結(jié)果比較，TNF?DNAzyme 的活性在GQDs 存在的條件下明顯得到了提高。與體外分子水平的結(jié)果對(duì)照，推測(cè)TNF?DNAzyme 活性提高的可能原因是其穩(wěn)定性得到了改善。當(dāng)然TNF?DNAzyme在細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)和體外有可能不同，因而作用機(jī)理等方面也有可能有差異；此外，因?yàn)镚QDs的協(xié)助TNF?DNAzyme也可能在細(xì)胞內(nèi)的累積量增加，因此也可能導(dǎo)致其活性提高。這些推斷還有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.5 TNF?DNAzyme／GQDs體系的細(xì)胞毒性

為進(jìn)一步了解該體系的作用效果和實(shí)際應(yīng)用的可能性，分別檢測(cè)了TNF?DNAzyme1、TNF?DNAzyme2、GQDs、TNF?DNAzyme1／GQDs 以及TNF?DNAzyme2／GQDs 體系對(duì)細(xì)胞活力的影響，結(jié)果（圖5）顯示，與TNF?DNAzyme1、TNF?DNAzyme2 單獨(dú)培育36 h 的Hela細(xì)胞，細(xì)胞存活率受TNF?DNAzyme1和TNF?DNAzyme2濃度影響不大，細(xì)胞始終保持較高的活力，見圖5（a）。與TNF?DNAzyme1／GQDs 和TNF?DNAzyme2／GQDs作用的細(xì)胞，存活率受GQDs 濃度影響顯著，隨濃度的升高而下降，在大于100 μg／mL 時(shí)，細(xì)胞凋亡明顯，存活率低于50%。Mg2+的預(yù)處理對(duì)細(xì)胞存活率沒(méi)有明顯的影響。TNF?DNAzyme／GQDs 體系的毒性主要來(lái)源于GQDs，但只要使用較低濃度的GQDs，體系的細(xì)胞毒性不影響DNAzyme的活性測(cè)定。

3 結(jié)論

圖5 TNF?DNAzyme/GQDs體系的細(xì)胞存活率Figure 5 Cell viability of Hela cells after treating with different concentrations of TNF?DNAzyme/GQDs

為了提高DNAzyme 細(xì)胞水平的穩(wěn)定性，設(shè)計(jì)了兩個(gè)靶向TNF?α 的DNAzyme，TNF?DNAzyme1 和TNF?DNAzyme2，探索它們和GQDs 形成復(fù)合體系時(shí)的穩(wěn)定性以及在細(xì)胞水平的活性。研究發(fā)現(xiàn)，TNF?DNA?zyme1、TNF?DNAzyme2 單獨(dú)與Hela 細(xì)胞作用不會(huì)對(duì)TNF?α 的蛋白表達(dá)水平產(chǎn)生顯著影響，但是當(dāng)TNF?DNAzyme與一定濃度的GQDs結(jié)合后，TNF?DNAzyme1／GQDs 和TNF?DNAzyme2／GQDs 體系均能顯著降低Hela 細(xì)胞內(nèi)TNF?α 蛋白的表達(dá)量，而且這些降低的結(jié)果是在GQDs 本身增加Hela 細(xì)胞內(nèi)TNF?α 蛋白的表達(dá)量的基礎(chǔ)上，說(shuō)明實(shí)際降低量比觀測(cè)到的更高。此結(jié)果表明GQDs 可以提高TNF?DNAzyme 在細(xì)胞內(nèi)的活性，從而抑制目的蛋白表達(dá)?；趯?duì)照實(shí)驗(yàn)以及體外分子水平的實(shí)驗(yàn)，推測(cè)DNAzyme 在細(xì)胞水平的高活性可能是因?yàn)镚QDs 提高了它的穩(wěn)定性。當(dāng)然DNAzyme的穩(wěn)定性是否直接導(dǎo)致它的活性增強(qiáng)，還需要其他機(jī)理實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證，但是這一初步結(jié)果表明利用DNAzyme調(diào)控蛋白表達(dá)的可能性。