微藻合成生物技術(shù)發(fā)展總結(jié)與展望：從底盤細(xì)胞到光合生物制造

欒國棟，張杉杉，呂雪峰，2

（1.中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所中國科學(xué)院生物燃料重點實驗室，青島266101；2.中國科學(xué)院潔凈能源創(chuàng)新研究院，大連116023）

微藻廣泛分布于各種生態(tài)環(huán)境，為地球生物圈提供了重要的初級生產(chǎn)力，是研究光合作用的重要模式體系，也是極具潛力的微生物光合制造平臺［1?4］。傳統(tǒng)微藻應(yīng)用技術(shù)開發(fā)的方向是：篩選、養(yǎng)殖優(yōu)質(zhì)微藻進(jìn)行油脂和高附加值天然產(chǎn)物的合成，并結(jié)合下游采收提取技術(shù)的開發(fā)來降低成本、提升效益。該技術(shù)模式體系成熟，但用于所采用的天然藻株遺傳背景復(fù)雜、改造困難，產(chǎn)品類型極為有限［5］。近年來，合成生物技術(shù)的發(fā)展使得重塑微藻光合生理模式和代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行生物能源和生物基化學(xué)品合成成為一條新的微藻生物技術(shù)發(fā)展路線。以可進(jìn)行遺傳操作的模式藻株為平臺，通過外源代謝途徑的導(dǎo)入和背景代謝網(wǎng)絡(luò)的改造，目前已經(jīng)實現(xiàn)了烴、糖、醇、酮、酸、萜類以及脂肪族化合物等數(shù)十種天然和非天然代謝產(chǎn)物的光驅(qū)固碳合成［6］。這種以光合微藻為底盤，通過光合固碳過程，將太陽能和二氧化碳直接轉(zhuǎn)化為生物燃料和生物基化學(xué)品的全新生物合成模式被稱為光合生物制造技術(shù)。

然而，經(jīng)典的模式藻株盡管有著較強的代謝可塑性，其生理和代謝功能上卻存在諸多缺陷，如細(xì)胞生長速度較慢、光合固碳效率較低、環(huán)境適應(yīng)能力較差等，基于模式藻株開發(fā)的光合細(xì)胞工廠，其產(chǎn)品合成能力難以達(dá)到“克／升”的產(chǎn)量水平，遠(yuǎn)低于常規(guī)異養(yǎng)微生物細(xì)胞工廠的效能，其生理功能也很難滿足規(guī)?；囵B(yǎng)、工程化應(yīng)用的需要［7?8］。微藻平臺光合生物制造技術(shù)要逐步走向工程化、規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化的推廣和應(yīng)用，其技術(shù)核心是開發(fā)生長速度快、合成效率高、逆境耐受能力強的高效能光合細(xì)胞工廠以及與之適配的過程工程技術(shù)體系，而技術(shù)取得突破的基礎(chǔ)和關(guān)鍵則是優(yōu)質(zhì)微藻底盤細(xì)胞的開發(fā)［9］。以具有應(yīng)用潛力的微藻藻株為平臺，系統(tǒng)應(yīng)用合成生物技術(shù)開發(fā)“可編輯、可控制、可放大”的新型微藻底盤細(xì)胞（圖1），對微藻特質(zhì)性光合生理和代謝功能進(jìn)行深入認(rèn)識、重新設(shè)計和定向改造，才能實現(xiàn)在大規(guī)模工程化培養(yǎng)體系中對光驅(qū)物質(zhì)能量定向轉(zhuǎn)化過程的人工控制，進(jìn)而推動光合生物制造技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。本文以此為導(dǎo)向，對微藻合成生物學(xué)和光合生物制造技術(shù)的進(jìn)展和面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行介紹，并展望本領(lǐng)域的未來發(fā)展方向。

1 微藻底盤細(xì)胞的基因組編輯和調(diào)控

圖1 針對光合生物制造技術(shù)發(fā)展需要開發(fā)“可編輯、可控制、可應(yīng)用”的微藻底盤細(xì)胞和光合細(xì)胞工廠Figure 1 Development of the engineering"editable，controllable and applicable"microalgae chassis cells and photosynthetic cell factories on the basis of the photosynthetic technology

天然微藻藻株無論是代謝網(wǎng)絡(luò)還是生理功能上都無法滿足未來光合生物制造技術(shù)的需求，而優(yōu)質(zhì)底盤細(xì)胞和工程藻株的開發(fā)需要對微藻藻株在基因組水平上進(jìn)行深度、系統(tǒng)改造，以實現(xiàn)藻株表型上的定制化改造。因此，“可編輯”是決定微生物底盤細(xì)胞開發(fā)和應(yīng)用的關(guān)鍵屬性，從技術(shù)上決定著對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)流、能量流進(jìn)行人工調(diào)控的可行性。微藻底盤細(xì)胞的“可編輯性”在很大程度上取決于其遺傳操作工具包的完善程度和效能［9?10］?，F(xiàn)階段，微藻遺傳操作工具的發(fā)展正在多個層面取得突破并逐步完善。（1）基因組精準(zhǔn)編輯技術(shù)。近年來，CRISRP?CAS9 以及一系列衍生的高效基因組編輯工具在原核藍(lán)藻和真核微藻中都得到成功應(yīng)用。相比較于傳統(tǒng)的同源雙交換策略，CRISPR 技術(shù)可以在不引入抗性標(biāo)簽的基礎(chǔ)上，一步實現(xiàn)微藻基因組上單堿基尺度的替換、插入和刪減，大大提升微藻基因組編輯的效率和精確性，有效增強微藻細(xì)胞生理和代謝表型的認(rèn)識精度和改造能力［11?13］。華盛頓大學(xué)圣路易斯分校的Pakrasi 團(tuán)隊，針對速生聚球藻UTEX2973 與其近源藻株P(guān)CC7942 基因組上的55 個差異SNP，使用CRISPR 技術(shù)逐一進(jìn)行突變和移植，成功鑒定到與UTEX2973 速生能力相關(guān)的3 個SNP［14］。（2）大片段DNA 操作技術(shù)。微藻底盤細(xì)胞開發(fā)和應(yīng)用過程中，在進(jìn)行基因組縮減、復(fù)雜功能模塊克隆和重構(gòu)等操作時，往往需要對百kb 以上大片段DNA 進(jìn)行直接刪除、克隆和整合，大片段DNA 操作技術(shù)從深度上影響著微藻光合生理和代謝網(wǎng)絡(luò)的改造能力。傳統(tǒng)的同源雙交換策略，在精度、載荷和效率上都難以滿足此類操作的要求，需要以RedET、CRISRP 技術(shù)為基礎(chǔ)，開發(fā)新型操作工具。中科院水生所的張承才團(tuán)隊，通過CRISPR?cpf1 工具的優(yōu)化和應(yīng)用，成功實現(xiàn)了魚腥藻PCC7120 中長達(dá)118 kb 的大片段基因組DNA 的直接刪除［15］。（3）基因表達(dá)多維調(diào)控技術(shù)。在微藻代謝網(wǎng)絡(luò)重塑過程中，往往需要同時對多個靶標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，而此類工程策略的實現(xiàn)需要應(yīng)用CRISPRi、sRNA 等反式作用工具。Yao等［16］首次在重要的模式藍(lán)藻藻株集胞藻PCC6803 中建立CRISPRi 技術(shù)，實現(xiàn)了對4 個醛還原酶和脫氫酶的同時敲低；天津大學(xué)張衛(wèi)文團(tuán)隊則實現(xiàn)了集胞藻PCC6803 中sRNA 工具的成功應(yīng)用，對集胞藻PCC6803 中丙二酰輔酶A 的多個競爭途徑同時弱化，成功將胞內(nèi)丙二酰輔酶A 的含量提高了41%，為后續(xù)細(xì)胞工廠的開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)［17］。微藻細(xì)胞具有染色體拷貝數(shù)高、膜結(jié)構(gòu)發(fā)達(dá)、生長周期長等遺傳、細(xì)胞和生理特征，在大腸桿菌、酵母等經(jīng)典模式體系中發(fā)展起來的基因組編輯和調(diào)控工具，面臨著與微藻代謝和生理網(wǎng)絡(luò)適配性、兼容性差的風(fēng)險。因此，針對微藻遺傳和代謝特性，開發(fā)適配、系統(tǒng)、高效的遺傳操作工具包將是微藻底盤細(xì)胞開發(fā)和光合生物制造技術(shù)發(fā)展的重要技術(shù)支撐。

2 微藻代謝網(wǎng)絡(luò)的優(yōu)化重塑與定向擴展

“可控制”指的是對微藻胞內(nèi)光合碳流、能量流的控制能力，具體體現(xiàn)在基于微藻底盤細(xì)胞進(jìn)行高效能光合細(xì)胞工廠的開發(fā)，實現(xiàn)微藻細(xì)胞內(nèi)光合碳流和能量流向目標(biāo)產(chǎn)品的高效、定向轉(zhuǎn)化。光合固碳是微藻生理和代謝活性的功能基礎(chǔ)，也是光合生物制造技術(shù)的原初動力。天然微藻細(xì)胞的光合固碳效率較低，經(jīng)過卡爾文循環(huán)固定并輸入的碳流難以支撐高效生物合成的需要；同時，天然微藻細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)中能夠合成的代謝產(chǎn)物種類有限，且產(chǎn)量較低，同樣無法滿足實質(zhì)性生產(chǎn)的要求。開發(fā)高效能的微藻光合細(xì)胞工廠，需要針對微藻底盤細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行優(yōu)化重塑和定向擴展，一方面提升光合固碳系統(tǒng)的效率，驅(qū)動單位時間內(nèi)微藻細(xì)胞固定更多的碳支撐下游生物合成，另一方面擴展光合代謝網(wǎng)絡(luò)，賦予微藻細(xì)胞更多、更強的催化反應(yīng)，將更多的碳和能量導(dǎo)向目標(biāo)產(chǎn)物的合成［8］。首先，天然微藻細(xì)胞為適應(yīng)自然界節(jié)律性變化的光照和碳源條件，在長期進(jìn)化過程中形成的光合系統(tǒng)和固碳機制，并不能適配于光合生物制造技術(shù)中持續(xù)、穩(wěn)定、強化的光照和補碳體系。針對高光適應(yīng)和利用的需要，加州大學(xué)伯克利分校的Melis 團(tuán)隊通過敲除集胞藻PCC6803 的別藻藍(lán)蛋白，有效地提升了藻株在高光強條件下的生物量積累能力［18］。針對微藻固碳系統(tǒng)，已經(jīng)證實通過卡爾文循環(huán)關(guān)鍵固碳蛋白的強化表達(dá)［19］、無機碳轉(zhuǎn)運系統(tǒng)強化和修飾［20］、新型固碳途徑的導(dǎo)入和調(diào)控［21］、碳損失的重吸收利用［22］等策略的開發(fā)和應(yīng)用，可以有效提升微藻的光合固碳效率，進(jìn)而為代謝產(chǎn)物合成提供更強的碳源供給和驅(qū)動力。瑞典烏普薩拉大學(xué)的Lindblad 團(tuán)隊在集胞藻PCC6803 中，通過過量表達(dá)RuBisco、SBPase、FBA 以及TK 等4 個關(guān)鍵節(jié)點蛋白，有效提升了聚球藻的光合放氧速率、細(xì)胞生長速度以及生物量積累速率［19］，而在工程藻株中使用該策略，則成功將乙醇產(chǎn)量提升了近70%［23］，充分證明從源頭上優(yōu)化光合固碳效能對開發(fā)優(yōu)質(zhì)光合細(xì)胞工廠的重要意義和巨大潛力。此外，微藻細(xì)胞以光合固碳過程為其生理和代謝的功能基礎(chǔ)，在光合生長、代謝和生物合成過程中存在光吸收、電子傳遞、光合磷酸化與碳同化等不同過程的耦合、碳匯機制與中心代謝的互作以及天然碳匯模塊和人工碳匯途徑之間的適配等復(fù)雜關(guān)系，為了實現(xiàn)微藻胞內(nèi)碳流的有效重定向，需要根據(jù)微藻自身生理和代謝特點，進(jìn)行有針對性的設(shè)計。區(qū)別于經(jīng)典的異養(yǎng)模式微生物，微藻細(xì)胞因為放氧型光合作用的存在，其胞內(nèi)還原力以NADPH 而非NADH 為主要形式，本研究團(tuán)隊在進(jìn)行藍(lán)藻乙醇光合細(xì)胞工廠開發(fā)過程中，通過將乙醇脫氫酶從NADH 偏好性替換成NADPH 偏好性后成功提高了工程藻株50%的乙醇合成效率［24］。上述研究工作充分表明結(jié)合微藻特質(zhì)性生理和代謝背景進(jìn)行途徑和功能模塊設(shè)計的重要性。

3 微藻光合細(xì)胞工廠工業(yè)應(yīng)用屬性的優(yōu)化

“可應(yīng)用”指的是基于合成生物技術(shù)開發(fā)的微藻光合細(xì)胞工廠適應(yīng)大規(guī)模培養(yǎng)過程中嚴(yán)苛工業(yè)環(huán)境條件和復(fù)雜過程工藝環(huán)節(jié)，進(jìn)行穩(wěn)定生長生產(chǎn)和有效產(chǎn)品回收的能力。基于整體成本和效益比的考慮，理想中的規(guī)?；夂仙镏圃鞈?yīng)該能夠在戶外、開放式環(huán)境下進(jìn)行，以自然光、經(jīng)過簡單處理的海水甚至工業(yè)污水和工業(yè)廢氣為主要原料，培養(yǎng)得到的生物質(zhì)和目標(biāo)產(chǎn)品的采收和提取也應(yīng)該盡可能地便捷、快速以及低成本化。而實際情況是在實驗室條件下開發(fā)的微藻光合細(xì)胞工廠面臨工業(yè)過程環(huán)境中嚴(yán)苛的溫度、光照、酸堿、鹽度以及生物污染等各種脅迫挑戰(zhàn)，往往無法維持細(xì)胞穩(wěn)定生長和產(chǎn)物穩(wěn)定積累；微藻生物質(zhì)采收和目標(biāo)產(chǎn)品提取都極為耗能且工序復(fù)雜，占據(jù)了整個技術(shù)鏈條成本的90%以上。在此背景下，應(yīng)該著重從兩方面優(yōu)化微藻底盤細(xì)胞和工程藻株的工業(yè)屬性：一是提升藻株的適切性和魯棒性，保證光合細(xì)胞工廠在動態(tài)、復(fù)雜、嚴(yán)苛的工業(yè)環(huán)境下能夠穩(wěn)定的保持生長和代謝能力；二是提升藻株與工業(yè)過程和技術(shù)體系的適配性，即通過藻株本身生理和代謝特性的編輯使之更符合工業(yè)體系的需求，降低對藻株大規(guī)模培養(yǎng)的工程難度。應(yīng)用合成生物技術(shù)提升藻株適切性和魯棒性的一個成功 例 子 是，Waditee 等［25］在 淡 水 依 賴 型 聚 球 藻PCC7942 中，過量表達(dá)來自耐鹽藻株Aphanothece halo?phytica 的Na+／H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白NhaP，成功獲得可以耐受0.5 mol/L NaCl的工程藻株，在此基礎(chǔ)上結(jié)合大腸桿菌過氧化氫酶KatE 的表達(dá)，成功提高了PCC7942 在海水中生長的能力，極大地提升了該藻株的工業(yè)應(yīng)用潛力。除了微藻細(xì)胞魯棒性和適切性的提升之外，其與工業(yè)過程體系適配性的優(yōu)化對提升技術(shù)鏈條整體經(jīng)濟(jì)競爭性也有重要意義，一個典型例子就是利用合成生物技術(shù)改變細(xì)胞形態(tài)，降低生物質(zhì)采收成本。目前廣泛應(yīng)用于光合細(xì)胞工廠開發(fā)的藍(lán)藻模式藻株大都是單細(xì)胞藻，與絲狀藻相比，其采收難度大、成本高。密歇根大學(xué)的Ducat 團(tuán)隊針對聚球藻PCC7942 中對形態(tài)有重要影響的Min 系統(tǒng)，對不同功能組分進(jìn)行表達(dá)豐度調(diào)控，成功地使細(xì)胞長度由3～5 μm 延長至毫米級別，且加長的細(xì)胞在常規(guī)重力條件下表現(xiàn)出了更好的沉降特性，非常有利于細(xì)胞采收［26］。隨著對微藻生理活動和代謝機制的深入認(rèn)識，以及各種高效、精確基因組編輯手段的發(fā)展完善，新一代具有良好工業(yè)應(yīng)用特性的微藻光合細(xì)胞工廠將能夠成功“定制”，并極大地促進(jìn)光合生物制造技術(shù)的規(guī)?；瘧?yīng)用［7］。

4 展望和結(jié)語

在自然界中，微藻光合作用為地球生命過程提供了至關(guān)重要的初級生產(chǎn)力，而在更廣闊時間尺度上則為地球環(huán)境從無氧到有氧的變化作出了決定性貢獻(xiàn)。合成生物技術(shù)的蓬勃發(fā)展推動了從微藻天然藻株到微藻底盤細(xì)胞再到微藻光合細(xì)胞工廠的功能實現(xiàn)，可以驅(qū)動微藻單細(xì)胞層面代謝流和能量流根據(jù)人工設(shè)計的精準(zhǔn)調(diào)控，最終實現(xiàn)單一平臺、單一過程中光能和二氧化碳向各種生物燃料和生物基化學(xué)品的定向轉(zhuǎn)化。未來，通過融合系統(tǒng)生物技術(shù)、過程工程、裝備工程乃至人工智能技術(shù)，還將進(jìn)一步實現(xiàn)微藻光合細(xì)胞工廠的合成能力在大時空尺度下的穩(wěn)定保持，從而驅(qū)動光合生物制造技術(shù)在工業(yè)環(huán)境下的成功應(yīng)用。