一種檢測(cè)鹽霉素膠體金試紙條的研制及其應(yīng)用

黃寶兵

摘 要：本研究應(yīng)用鹽霉素單克隆抗體研制出一種能夠檢測(cè)動(dòng)物源性食品中鹽霉素的膠體金免疫層析試紙條，檢測(cè)限為20μg/kg，檢測(cè)時(shí)間僅為15min，假陽性率和假陰性率均為0，符合《獸藥殘留檢測(cè)試劑盒（條、卡）備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》的要求。該試紙條能夠應(yīng)用于基層實(shí)驗(yàn)室的大批量樣本檢測(cè)，具有實(shí)際意義，并且未見免疫方法相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，具有創(chuàng)新性。

關(guān)鍵詞：鹽霉素? 膠體金免疫層析試紙條? 快速檢測(cè)

引言

鹽霉素屬于聚醚類抗生素，不僅常用于防治雞、豬等畜禽的球蟲病，還能作為豬等家畜的生長(zhǎng)促進(jìn)劑。為牟取更高收益，不良畜牧業(yè)主會(huì)過量使用鹽霉素，導(dǎo)致動(dòng)物源性食品中的鹽霉素超標(biāo)，進(jìn)而影響人類健康。因此，檢測(cè)動(dòng)物源性食品中的鹽霉素具有必要性。目前，檢測(cè)鹽霉素的方法主要有高效液相色譜柱后衍生化法、UPLC-MS/MS法、液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法等儀器方法[1-6]，但鮮有快速檢測(cè)方法。上述儀器檢測(cè)方法耗時(shí)較長(zhǎng)，單臺(tái)儀器成本在百萬元以上，難以用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)工作。膠體金免疫層析試紙條屬于快速檢測(cè)方法，檢測(cè)時(shí)間小于30min，試紙條成本幾元至幾十元不等，非常適合基層實(shí)驗(yàn)室的大批量檢測(cè)工作。本研究開發(fā)了一種檢測(cè)鹽霉素的膠體金免疫層析試紙條，其能夠檢測(cè)動(dòng)物源性食品中的鹽霉素抗生素殘留，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值較高。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹽霉素、馬杜霉素、紅霉素、泰樂菌素、莫能菌素等標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%），購自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心;氯金酸（HAuCl4·3H2O），購自美國(guó)Sigma公司;檸檬酸三鈉，購自北京百欣試劑公司。

1.2 方法

1.2.1 膠體金的制備

取0.01%氯金酸水溶液100mL加熱至沸騰;一邊攪拌，一邊準(zhǔn)確加入1%檸檬酸三鈉溶液1.5mL;待氯金酸水溶液變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)煮沸15min，冷卻后于4℃避光保存[7-10]。

1.2.2 鹽霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備

在磁力攪拌下，用0.2mol/L Na2CO3溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液的pH值至7.2，每毫升膠體金溶液中加入50μg鹽霉素單克隆抗體，混勻，靜置10min，加入10%BSA，使其在膠體金溶液中的體積百分含量為1%，靜置10min。然后離心、洗滌、重懸，置于4℃?zhèn)溆肹7-10]。

1.2.3 結(jié)合物釋放墊的制備

將結(jié)合物釋放墊浸泡于含有牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在緩沖液中的濃度為0.5%）、pH值7.2、0.5mol/L的磷酸鹽緩沖液中，均勻浸濕1h，37℃烘3h備用。用Isoflow點(diǎn)膜儀將制備好的鹽霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物均勻噴涂在結(jié)合物釋放墊上，每1cm結(jié)合物釋放墊噴涂0.01mL鹽霉素單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物后，置于37℃環(huán)境中（濕度<20%）60min后取出，置于干燥環(huán)境（濕度<20%）中保存?zhèn)溆肹7-10]。

1.2.4 反應(yīng)膜的制備

將鹽霉素包被原包被到反應(yīng)膜上構(gòu)成檢測(cè)線，將羊抗鼠抗抗體包被在反應(yīng)膜上構(gòu)成質(zhì)控線[7-10]。

包被過程：用磷酸緩沖液將鹽霉素包被原稀釋至10mg/mL，用Isoflow點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測(cè)線（T線），包被量為0.8μL/cm;用0.01mol/L、pH值7.4的磷酸鹽緩沖液將羊抗鼠抗抗體稀釋到200μg/mL，用Isoflow點(diǎn)膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線（C線），包被量為1.0μL/cm。將包被好的反應(yīng)膜置于37℃條件下干燥2h，備用[7-10]。

1.2.5 樣品吸收墊的制備

將樣品吸收墊置于含0.5%牛血清白蛋白（體積分?jǐn)?shù)）、pH值7.2、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液中浸泡2h，37℃烘2h，備用[7-10]。

1.2.6 檢測(cè)方法

用吸管吸取70μL待檢樣品溶液垂直滴加于加樣孔中，液體流動(dòng)時(shí)開始計(jì)時(shí)，反應(yīng)5～10min，根據(jù)示意圖判定結(jié)果或通過膠體金分析儀讀取檢測(cè)結(jié)果，其它時(shí)間判讀無效[7-10]。

1.2.7 樣本檢測(cè)限

在空白雞肉、豬肉等動(dòng)物源性食品樣本中分別添加鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、10、15、20、25、30μg/L，按照“1.2.6”所述方法用3批試紙條進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定樣本檢測(cè)限[9-10]。

1.2.8 試紙條的特異性

分別配制500μg/L的馬杜霉素、紅霉素、泰樂菌素、莫能菌素等藥物，用該試紙條檢測(cè)，重復(fù)3次，判斷試紙條的特異性。

1.2.9 試紙條的準(zhǔn)確性

農(nóng)業(yè)部文件要求，以假陽性率和假陰性率表示膠體金免疫層析法的準(zhǔn)確性。取經(jīng)儀器確證的50份陰性雞肉、豬肉等動(dòng)物源性食品樣品（質(zhì)量濃度小于20μg/kg），50份陽性雞肉、豬肉等動(dòng)物源性食品樣品（質(zhì)量濃度大于20μg/kg），然后用該試紙條進(jìn)行鹽霉素藥物殘留檢測(cè)，計(jì)算假陽性率和假陰性率?！东F藥殘留檢測(cè)試劑盒（條、卡）備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》規(guī)定：試紙條假陽性率應(yīng)小于5%，假陰性率應(yīng)為零[9-10]。

1.2.10 試紙條的穩(wěn)定性

將試紙條保存于2～8℃環(huán)境中，每隔1個(gè)月檢測(cè)試紙條的準(zhǔn)確性，連續(xù)測(cè)定15個(gè)月。具體方法為：分別檢測(cè)經(jīng)儀器確證的20份陰性雞肉、豬肉動(dòng)物源性食品樣品（質(zhì)量濃度小于20μg/kg），20份陽性雞肉、豬肉動(dòng)物源性食品樣品（質(zhì)量濃度大于20μg/kg），重復(fù)測(cè)定2次，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定試紙條的穩(wěn)定性[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金的鑒定

肉眼觀察制備的膠體金，其顏色為酒紅色、均勻度較好、無雜質(zhì)、透明度較高。取冷卻后的膠體金溶液在透射電鏡下觀察膠體金顆粒的均一程度，并測(cè)量金顆粒粒徑。經(jīng)透射電鏡觀察，膠體金顆粒分布比較均勻，金顆粒的粒徑約為20nm[9-10]。

2.2 樣本檢測(cè)限

配置鹽霉素濃度分別為0、10、15、20、25、30μg/L的雞肉、豬肉動(dòng)物源性食品樣品，按照“1.2.7”所述步驟進(jìn)行檢測(cè)，確定檢測(cè)限。該試紙條的檢測(cè)限為20μg/kg，見表1、圖3、圖4。

2.3 特異性

使用試紙條檢測(cè)500μg/L的馬杜霉素、紅霉素、泰樂菌素、莫能菌素等藥物，結(jié)果均呈陰性，表明該試紙條特異性較好。

2.4 準(zhǔn)確性

用試紙條檢測(cè)50份陰性動(dòng)物源性食品樣品，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，說明假陽性率低于5%;用試紙條檢測(cè)50份陽性動(dòng)物源性食品樣品，試紙條檢測(cè)結(jié)果均為陽性，說明試紙條假陰性率為零，符合《獸藥殘留檢測(cè)試劑盒（條、卡）備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》的要求。

2.5 穩(wěn)定性

12個(gè)月內(nèi)，試紙條的假陽性率和假陰性率均符合要求，從第14個(gè)月起，試紙條會(huì)出現(xiàn)少量失效或假陽性等現(xiàn)象。

3 討論

目前，有關(guān)應(yīng)用快速檢測(cè)方法檢測(cè)鹽霉素的文獻(xiàn)非常有限，本文制備出一種商品化的膠體金免疫層析試紙條，并按照《獸藥殘留檢測(cè)試劑盒（條、卡）備案技術(shù)資料要求及審查工作程序》的要求對(duì)試紙條進(jìn)行了特異性、準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性等性能測(cè)試，均符合要求。該試紙條的檢測(cè)時(shí)間僅為15min，比現(xiàn)有文獻(xiàn)中的儀器方法用時(shí)更短，操作更簡(jiǎn)便;檢測(cè)限為20μg/kg，且未見免疫方法相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

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