程序性壞死在髁突軟骨退變中的作用

何峰 葉濤 馬原軍 楊祖閣 李天樂 仝昕 于世賓

顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(temporomandibular disorders, TMD)的人群發(fā)病率高達(dá)20%～40%，顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(temporomandibular joint osteoarthritis, TMJ OA)是其重癥形式[1]。關(guān)節(jié)軟骨退變是OA最典型的病理特征之一[2]。 軟骨細(xì)胞死亡是關(guān)節(jié)軟骨退變中的核心事件，但其確切發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前公認(rèn)的細(xì)胞死亡類型主要有“凋亡”、“自噬”和“壞死”三種[3]，在細(xì)胞凋亡、自噬進(jìn)程中不存在細(xì)胞內(nèi)外大規(guī)模的物質(zhì)交流，一般不引起或僅有輕微的周圍組織反應(yīng)；而壞死發(fā)生時，細(xì)胞器腫脹、細(xì)胞膜完整性嚴(yán)重破壞、細(xì)胞及其內(nèi)容物崩解進(jìn)入周圍組織[4-5]。目前程序性壞死(Necroptosis)是研究最多的壞死途徑，其發(fā)生機(jī)制是由腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)作用于細(xì)胞膜上的腫瘤壞死因子受體啟動，在細(xì)胞內(nèi)由受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinase 1, RIPK1)和RIPK3傳遞死亡信號，募集并磷酸化混合系激酶區(qū)域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein, MLKL)形成壞死小體，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡、細(xì)胞膜破裂[6-7]。細(xì)胞膜破裂所釋放的內(nèi)容物將作為損傷相關(guān)的分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)，如高遷移率族蛋白1(high mobility group protein B1, HMGB1)等。DAMPs可以在軟骨或關(guān)節(jié)腔內(nèi)以自分泌或旁分泌的方式誘導(dǎo)周圍細(xì)胞分泌TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)等促炎/降解因子[8-9]，進(jìn)一步加重軟骨細(xì)胞死亡及軟骨基質(zhì)降解。但截至目前Necroptosis在TMJ OA中的作用未見報道，本研究應(yīng)用本實驗室建立的髁突軟骨退變動物模型，探究軟骨細(xì)胞Necroptosis在TMJ髁突軟骨退變中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組及模型建立

6 周齡雌性SD大鼠48 只(第四軍醫(yī)大學(xué)動物中心提供)，隨機(jī)分為Con、E2、UAC和U+E2組，每組12 只。按照報道的方法[10]，UAC、U+E2組通過在左側(cè)上、下前牙分別粘接套筒冠，形成不良修復(fù)體，從而造成單側(cè)前牙反；Con、E2組實施同樣的操作，但最終不粘接不良修復(fù)體。 E2、 U+E2組每日上午8:00～9:00腹腔內(nèi)注射17β-雌二醇(ab120657， E2, Abcam, 英國)80 μg； Con、UAC組注射相同體積的生理鹽水。

1.2 取材及組織塊的處理

3 周后處死， 將每組中6 只大鼠的雙側(cè)TMJ于4%多聚甲醛中固定24 h，脫鈣后石蠟包埋切片；另6 只的雙側(cè)TMJ于-80 ℃凍存，用于Western blot檢測。

1.3 HE染色

石蠟切片常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下采集圖像，通過Leica Q-win軟件測量中帶從軟骨表面到骨軟骨交界處的距離。

1.4 番紅O-固綠染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，1%固綠染色2 min， 1%醋酸酒精漂洗10 s； 1%番紅O染色5 min， 95%酒精漂洗15 s； 二甲苯透明，封片。采集圖像后每個樣本隨機(jī)選取5 個高倍視野(×100)，計算番紅O著色面積百分比。

1.5 免疫組化染色

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，參照免疫組化試劑盒說明書中描述的SABC法進(jìn)行免疫組化染色。一抗信息如下：RIPK3抗體(1 ∶100, Abcam, ab62344)、p-MLKL抗體(1 ∶200, Affinity, AF7420)、HMGB1抗體(1 ∶200, Abcam, ab18256)、TNF-α抗體(1 ∶800, Affinity, AF7014)。采集圖像后，在×100視野下的軟骨中帶隨機(jī)選取3 個300 dpi×300 dpi且覆蓋全部肥大層的區(qū)域，計算陽性細(xì)胞率。

1.6 Western blot

利用Tripure裂解液提取髁突軟骨蛋白，BCA法蛋白定量。常規(guī)蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜。非特異性蛋白封閉15 min后，一抗孵育， 4 ℃過夜。一抗信息如下：RIPK3抗體(1 ∶500, Abcam, ab62344)、p-MLKL抗體(1 ∶1000, Affinity, AF7420)、β-actin抗體(1 ∶2000, Cell Signaling Technology, 4970S)、TNF-α抗體(1 ∶1000, Affinity, AF7014)、HMGB1抗體(1 ∶1000, Abcam, ab18256)、MMP13抗體(1 ∶1000, Abcam, ab39012)、ADAMTS5抗體(1 ∶250, Abcam, ab41037)。二抗孵育后常規(guī)ECL發(fā)光，然后在Chemi-Doc XRS+WB發(fā)光成像系統(tǒng)下顯影。圖像采集后運用Image Lab 5.2.1軟件進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 E2補充或/和UAC刺激可導(dǎo)致髁突軟骨退變

圖 1A顯示Con和E2組各層細(xì)胞層次分明，肥大層細(xì)胞排列緊密；UAC和U+E2組各層細(xì)胞排列輕度紊亂，肥大層細(xì)胞稀疏。E2、UAC及U+E2組髁突軟骨中帶厚度均低于Con組(P<0.01)；與E2組相比，U+E2組軟骨中帶厚度變薄(P<0.05)(圖 1B)。

圖 1C顯示，在Con組中番紅O染色陽性的蛋白聚糖均勻、規(guī)則地分布于軟骨肥大層，且與固綠著色的纖維層、增殖層及軟骨下骨分界清晰；而E2、UAC及U+E2著色、分布不均勻。與Con相比，E2、UAC及U+E2組番紅O染色陽性面積比顯著降低(P<0.01)；且與E2、UAC組相比，U+E2組蛋白聚糖在全層軟骨中所占面積比更小(P< 0.01)(圖 1D)。

2.2 Necroptosis關(guān)鍵分子的表達(dá)與軟骨退變程度相關(guān)

免疫組化染色結(jié)果顯示RIPK3、p-MLKL陽性細(xì)胞主要分布于軟骨肥大層(圖 2A)。E2、UAC及U+E2組RIPK3、p-MLKL陽性細(xì)胞率顯著高于Con組(P<0.01)；且U+E2組陽性細(xì)胞率顯著高于E2組(RIPK3：P<0.01； p-MLKL：P<0.05)(圖 2B)。

圖 2C顯示：E2、UAC及U+E2組RIPK3、MLKL、p-MLKL蛋白表達(dá)量顯著高于Con組(P<0.01)；且U+E2組蛋白表達(dá)量顯著高于E2組(P<0.01)(圖 2C、2D)。

2.3 Necroptosis相關(guān)DAMPs分子和促炎/降解因子的表達(dá)與軟骨退變程度相關(guān)

圖 1 大鼠TMJ HE和番紅O-固綠染色

圖 2 髁突軟骨中RIPK3和p-MLKL的蛋白表達(dá)

如圖 3A所示，HMGB1、TNF-α陽性細(xì)胞主要分布于軟骨肥大層。E2、UAC及U+E2組HMGB1、TNF-α陽性細(xì)胞率均顯著高于Con組(P<0.01)；且U+E2組陽性細(xì)胞率均顯著高于E2組(P<0.05)(圖 3B)。

如圖 3C、3D結(jié)果所示，E2組HMGB1、TNF-α蛋白表達(dá)量均顯著高于Con組(P<0.01，P<0.05)；UAC組HMGB1、TNF-α、MMP13和ADAMTS5蛋白表達(dá)量均顯著高于Con組(P<0.01)；U+E2組HMGB1、TNF-α、MMP13和ADAMTS5蛋白表達(dá)量均顯著高于Con組和E2組(P<0.01)；且U+E2組HMGB1、MMP13蛋白表達(dá)量顯著高于UAC組(P<0.01)。

圖 3 髁突軟骨中HMGB1、TNF-α、MMP13和ADAMTS5的蛋白表達(dá)

3 討 論

TMD是一類口腔常見疾病，主要表現(xiàn)為頜面部疼痛、關(guān)節(jié)雜音和下頜運動受限，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。咬合紊亂是TMD一個重要致病因素，據(jù)此我們構(gòu)建了單側(cè)前牙反(UAC)模型[11]，該模型創(chuàng)傷小、易操作且能夠很好地模擬臨床；同時，大量研究表明TMD好發(fā)于中青年女性[12-14]，提示雌激素在TMD/TMJ OA的發(fā)病進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。本文在構(gòu)建E2、UAC和UAC+E2模型3 周后，E2、UAC組即出現(xiàn)軟骨厚度顯著變薄，軟骨基質(zhì)中蛋白多糖明顯減少；相比較于E2組、UAC組，UAC+E2軟骨厚度更薄，蛋白多糖含量更少，因此E2、UAC和UAC+E2模型能夠快速有效地導(dǎo)致髁突軟骨不同程度的退變。

Necroptosis發(fā)生后細(xì)胞膜破裂所釋放的細(xì)胞內(nèi)容物中存在大量對周圍組織有害的物質(zhì)，其中近年來研究最多的就是DAMPs。DAMPs指機(jī)體自身細(xì)胞死亡所釋放的內(nèi)源性危險信號分子，目前軟骨中研究較多的有高遷移率族蛋白(HMGBs)、晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)、警報素(Alarmins)等[8,15]。Hamada 等[16]證實OA患者的滑液中存在大量的HMGB1，國內(nèi)龍星教授課題組的研究也發(fā)現(xiàn)TMJ OA患者的關(guān)節(jié)盤及滑膜組織中的HMGB1表達(dá)顯著升高[17]。亦有研究證實HMGB1可以直接作用于細(xì)胞膜上Toll樣受體(Toll-like receptors, TLRs)和趨化因子受體(Chemokine receptors, CXCRs)等，進(jìn)而啟動細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引發(fā)促炎效應(yīng)[4,18-19]。相關(guān)類似的研究表明Necroptosis發(fā)生后軟骨細(xì)胞所釋放的HMGB1等關(guān)鍵DAMPs可能在軟骨內(nèi)或關(guān)節(jié)腔內(nèi)以自分泌或旁分泌的方式誘導(dǎo)周圍細(xì)胞分泌TNF-α、IL1β、IL8、MMPs、ADAMTs等促炎/降解因子，進(jìn)一步誘發(fā)軟骨細(xì)胞Necroptosis和軟骨基質(zhì)降解，形成惡性循環(huán)，不斷促進(jìn)OA軟骨退變的發(fā)展[4,8-9]。本研究發(fā)現(xiàn)E2、UAC和U+E2組退變髁突軟骨中Necroptosis關(guān)鍵分子RIPK3、p-MLKL陽性細(xì)胞率和蛋白表達(dá)量均顯著升高，且表達(dá)水平與軟骨退變程度相關(guān)，這提示Necroptosis參與了髁突軟骨的退變進(jìn)程。E2、UAC及U+E2組退變髁突軟骨中HMGB1、TNF-α、MMP13和ADAMTS5等蛋白表達(dá)的升高，以及相關(guān)蛋白表達(dá)量與軟骨退變相關(guān)，提示髁突軟骨退變進(jìn)程中，軟骨細(xì)胞Necroptosis發(fā)生后細(xì)胞破裂所釋放的DAMPs水平上升，這些DAMPs可能作用于周圍正常的軟骨細(xì)胞，刺激TNF-α等炎性/降解因子的分泌，從而誘發(fā)進(jìn)一步的軟骨退變。綜上Necroptosis參與了髁突軟骨的退變進(jìn)程，其相關(guān)分子可能成為今后TMD/TMJ OA治療的新靶點。