甲狀旁腺素相關(guān)蛋白核定位序列及C-末端缺失對幼年小鼠下頜切牙發(fā)育影響及機(jī)制研究

劉洪 顏成東 蔣尚飛

甲狀旁腺素相關(guān)蛋白(parathyroid hormone related protein, PTHrP)已經(jīng)被證實(shí)分布于人體的多種器官和組織，如牙齒、骨骼、皮膚等[1]。其N末端的氨基酸序列和甲狀旁腺素(parathyroid hormone, PTH)高度同源，并且共享PTH/PTHrP 1型受體(PTH/PTHrP type 1 receptor)，發(fā)揮類似的生理學(xué)功能；而其核定位序列和C-末端能夠進(jìn)入胞核，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞周期功能[2]。利用基因工程手段制作僅表達(dá)PTHrP蛋白N末端1-84位氨基酸的動物模型PTHrP knock in(PTHrP KI)小鼠[3]，并且和野生型(wild type, WT)小鼠相比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTHrP KI小鼠的下頜磨牙發(fā)育明顯不良，Hertwig上皮根鞘(herswig's epithelial root，HERs)細(xì)胞增殖減少，顯示細(xì)胞凋亡的指標(biāo)如p27明顯上調(diào)[4]?；钚匝?reactive oxygen species, ROS)由線粒體在進(jìn)行呼吸作用時產(chǎn)生，是有氧代謝的副產(chǎn)物，包括超氧陰離子自由基(O2-·)、過氧化氫(H2O2)、羥自由基(OH·)和單線態(tài)氧等[5]。研究表明，ROS能直接損傷DNA導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，而體內(nèi)多余的ROS能夠被超氧化物歧化酶1(Superoxide dismutase 1，SOD1)、超氧化物歧化酶2(Superoxide dismutase 2，SOD2)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)等酶抗氧化系統(tǒng)所清除[6-8]。本次研究使用2 周齡PTHrP KI小鼠并與同窩的WT小鼠比較下頜切牙的發(fā)育、礦化和凋亡情況，并檢測相關(guān)酶抗氧化系統(tǒng)的RNA表達(dá)水平。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

將成年雌雄PTHrP KI雜合子小鼠(小鼠購自江蘇省實(shí)驗動物中心)合籠，子代小鼠出生后立即剪尾尖提取DNA，使用PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段并使用BstEⅡ內(nèi)切酶進(jìn)行酶切PCR產(chǎn)物，電泳后鑒定基因型[9]，獲得同窩的野生型(wild type, WT)小鼠和PTHrP KI仔鼠，為了控制實(shí)驗的均一性，控制每窩WT小鼠和PTHrP小鼠均為2 只。小鼠生長至2 周齡使用頸椎脫臼法處死、取材，WT小鼠和PTHrP KI小鼠分別取20 只進(jìn)行X線檢查、切片染色和real-time RT-PCR檢測。本次實(shí)驗經(jīng)過江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院倫理委員會審核通過。

1.2 取材

待WT小鼠和PTHrP KI小鼠生長至2周后，頸椎脫臼處死，解剖分離左右兩側(cè)下頜骨，左側(cè)下頜骨解剖分離下頜切牙后置于液氮中保存進(jìn)行后續(xù)的real-time RT-PCR檢測，右側(cè)下頜骨使用免疫電鏡固定液進(jìn)行固定后先進(jìn)行X線掃描，然后使用乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣30 d，待脫鈣完成后沿著下頜第二磨牙的遠(yuǎn)中將下頜骨切斷，分別脫水包埋，下頜骨前部沿著下頜第一磨牙的近中根管方向進(jìn)行切片，片厚5 μm，用來進(jìn)行HE染色、總膠原染色和免疫組織化學(xué)染色；后部沿著近遠(yuǎn)中方向進(jìn)行切片，片厚5 μm，用來進(jìn)行原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記檢測(TUNEL)染色。

1.3 X線掃描

將用免疫電鏡固定液固定后的小鼠下頜骨使用805型X光機(jī)(Faxitron公司生產(chǎn),德國)進(jìn)行X線掃描，并且分別測量X光片上的小鼠下頜切牙的長度和切緣厚度。

1.4 HE染色

石蠟切片使用先使用二甲苯進(jìn)行脫蠟，然后從高濃度到低濃度的梯度酒精當(dāng)中進(jìn)行水化，使用蘇木素進(jìn)行染色5 min，流水沖洗至細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色，使用伊紅染色30 s，再使用從低濃度到高濃度直至無水酒精進(jìn)行脫水，二甲苯透明3 次，中性樹膠封片。

1.5 總膠原染色

石蠟切片順序使用二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后使用苦味酸-直紅染色液熱色30 min，流水沖洗后蘇木素染色30 s，再次流水沖洗后梯度酒精脫水，二甲苯透明后使用中性樹膠封片。

1.6 I型膠原免疫組化染色

石蠟切片循序二甲苯脫蠟，梯度酒精水化后使用0.5%牛睪丸透明質(zhì)酸酶消化30 min后流水沖洗，用5%正常兔血清封閉20 min，分別加入鼠源I型膠原單克隆一抗(1 ∶500，Merk公司, 美國)4 ℃孵育過夜，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗，加兔抗鼠IgG二抗(1 ∶200，Sigma公司, 美國)，室溫孵育30 min；PBS清洗，加使用生物素-親和素-橋聯(lián)堿性磷酸酶酶標(biāo)液(ABC-AP， Vector公司, 美國)孵育，PBS清洗，堿性磷酸酶染色液染色，甲基綠復(fù)染，加熱明膠并過濾后使用過濾后的明膠封片。

1.7 TUNEL染色

石蠟切片循序二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，使用0.01%蛋白酶K孵育5 min，使用PBS清洗，用TUNEL反應(yīng)混合物(Boehringer Mannheim公司， 英國)在37 ℃下孵育60 min，再次使用PBS清洗，converter-AP(Vector公司， 美國)孵育30 min后繼續(xù)使用PBS清洗，堿性磷酸酶顯色液染色，甲基綠復(fù)染，加熱明膠并過濾后使用過濾后的明膠封片。

1.8 實(shí)時熒光定量RT-PCR實(shí)驗

從液氮中取出小鼠下頜切牙，在研缽中搗碎，一步法提取總 RNA，常規(guī)方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用real timeRT-PCR方法檢測骨鈣素(osteocalcin, OCN)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px的mRNA表達(dá)水平。用7300 System SDS software 軟件(Applied Systems 公司，美國)統(tǒng)計分析實(shí)驗結(jié)果，PTHrP KI組各個指標(biāo)以WT組作為參照。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

實(shí)驗數(shù)據(jù)輸入SPSS 10.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行組間單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 X線掃描結(jié)果

X線掃描結(jié)果顯示，PTHrP KI組小鼠的下頜切牙長度為(6.34±0.31) mm，切緣厚度為(0.34±0.02) mm，而WT組小鼠下頜切牙長度為(8.83±0.34) mm，切緣長度為(0.47±0.03) mm，PTHrP KI組小鼠下頜切牙長度、切緣厚度均明顯低于WT組小鼠(P<0.05)(圖 1，表 1)。

2.2 HE染色、總膠原染色、I型膠原免疫組化染色和TUNEL染色結(jié)果

通過HE染色檢測前期牙本質(zhì)和牙本質(zhì)，并且計算前期牙本質(zhì)占總牙本質(zhì)的比例，WT小鼠的前期牙本質(zhì)占總牙本質(zhì)比例明顯高于PTHrP KI小鼠(P<0.01)；使用總膠原染色方法測定根管厚度， WT小鼠的髓腔壁牙本質(zhì)厚度明顯高于PTHrP KI小鼠(P<0.01)；I型膠原免疫組化染色表明WT小鼠的I型膠原陽性面積占切牙面積的百分比明顯高于PTHrP KI小鼠(P<0.01)；TUNEL染色結(jié)果顯示W(wǎng)T小鼠的切牙末端凋亡細(xì)胞比例明顯低于PTHrP KI小鼠(P<0.01)(圖 2、 表 2)。

圖 1 2 組小鼠X線掃描

表 1 小鼠下頜切牙長度和切緣厚度 (n=20,

圖 2 2 種小鼠下頜骨及牙齒染色方法檢測 (A～F:×400, G、 H: ×200)

表 2 HE染色、總膠原染色、I型膠原免疫組化染色和TUNEL染色結(jié)果統(tǒng)計

表 3 實(shí)時熒光定量RT-PCR實(shí)驗結(jié)果

2.3 實(shí)時熒光定量RT-PCR實(shí)驗結(jié)果

實(shí)時熒光定量RT-PCR實(shí)驗結(jié)果顯示，WT小鼠的ALP、OCN、SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px的mRNA表達(dá)水平均高于PTHrP KI小鼠(P<0.01)(表 3)。

3 討 論

PTHrP最初被發(fā)現(xiàn)在癌癥惡液質(zhì)患者中，這些患者均伴有明顯的消瘦和高鈣血癥[10]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，PTHrP在血液中的濃度極低，在機(jī)體發(fā)育的不同時期、不同組織中均有表達(dá)，PTHrP的不同片段具有不同的生理功能， 其N-末端1-84位氨基酸序列與PTH相同，使用共同的受體，也發(fā)揮調(diào)節(jié)鈣、磷水平的作用，核定位序列(87-107位氨基酸)能進(jìn)入細(xì)胞核起到胞內(nèi)分泌的作用， C-末端有抑制骨吸收作用[11]。利用基因工程技術(shù)制作僅表達(dá)PTHrP蛋白N-末端1-84位氨基酸的小鼠動物模型，發(fā)現(xiàn)小鼠生存期極短，僅為15～18 d，盡管該種動物模型的血清鈣、磷濃度基本正常，但是小鼠的多種器官均發(fā)育不良[12]。

本次實(shí)驗利用2 周齡PTHrP KI小鼠進(jìn)行實(shí)驗，并且和同窩的WT小鼠進(jìn)行對照。X光掃描表明，PTHrP KI小鼠下頜切牙的長度明顯縮短，并且切緣的厚度也明顯減少，X光檢查的實(shí)驗初步表明PTHrP核定位序列和C-末端的缺失可能導(dǎo)致了小鼠下頜切牙的發(fā)育障礙；進(jìn)一步進(jìn)行HE染色檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTHrP KI小鼠下頜切牙的前期牙本質(zhì)所占的比例明顯增加。此外，實(shí)時熒光定量RT-PCR實(shí)驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTHrP核定位序列和C-末端的缺失導(dǎo)致了小鼠下頜切牙ALP和OCN的mRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)。研究表明，在牙本質(zhì)的形成過程當(dāng)中，成牙本質(zhì)細(xì)胞不斷地合成和分泌有機(jī)基質(zhì)，然后礦物不斷地在有機(jī)基質(zhì)當(dāng)中沉積形成牙本質(zhì)，而前期牙本質(zhì)是在成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙本質(zhì)之間的一層沒有礦化的有機(jī)基質(zhì)，ALP礦化過程中能夠發(fā)揮促進(jìn)鈣離子與磷酸鹽結(jié)合形成無機(jī)物結(jié)晶的作用，在牙本質(zhì)的鈣化開始后，成牙本質(zhì)細(xì)胞中的ALP表達(dá)水平明顯增高；而OCN是一種牙本質(zhì)非膠原蛋白，主要由成牙本質(zhì)細(xì)胞合成和分泌，在牙本質(zhì)的礦化過程中起到重要的作用[13]。本研究結(jié)果表明，PTHrP核定位序列和C-末端的缺失導(dǎo)致了小鼠下頜切牙前期牙本質(zhì)比例增加，牙本質(zhì)礦化不良。

總膠原的染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTHrP KI小鼠下頜切牙髓腔壁的厚度明顯減少，進(jìn)一步的I型膠原免疫組化染色表明，PTHrP KI小鼠的I型膠原陽性面積也明顯減少。牙本質(zhì)的胞外基質(zhì)中主要成分是膠原蛋白，在膠原蛋白中，尤以I型膠原為主；另外還有少量的蛋白多糖和糖蛋白；這些膠原蛋白按照特定的空間構(gòu)象進(jìn)行排列，構(gòu)成了牙本質(zhì)的主要框架結(jié)構(gòu)，礦物質(zhì)沉積于其間[14]。上述實(shí)驗結(jié)果表明，PTHrP核定位序列和C-末端的缺失導(dǎo)致了小鼠下頜切牙的胞外基質(zhì)分泌減少。

此外，TUNEL染色表明，PTHrP KI小鼠下頜切牙頸環(huán)及附近牙髓細(xì)胞凋亡明顯增加。小鼠的下頜切牙終身生長，其原因在于小鼠的下頜切牙末端上皮結(jié)構(gòu)不能像磨牙一樣形成HERs結(jié)構(gòu)而是被稱為頸環(huán)，因而不能形成真正意義上的牙根而終止牙齒的發(fā)育[15]。進(jìn)一步對SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px等酶抗氧化mRNA的表達(dá)水平檢查也發(fā)現(xiàn)，PTHrP KI小鼠下頜切牙的SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px的mRNA的表達(dá)水平明顯降低。 線粒體在進(jìn)行呼吸作用時，可以產(chǎn)生 ROS，過多的ROS如果不能被及時的清除，不僅能夠直接攻擊DNA導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，也可以通過Fas通路、P53/MPTP 通路、NF- B通路等信號通路引發(fā)細(xì)胞凋亡；正常情況下，酶抗氧化系統(tǒng)能夠及時的清除ROS，使得ROS 維持在低水平[16-17]。本研究結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)，PTHrP核定位序列和C-末端的缺失導(dǎo)致了小鼠下頜切牙的SOD1、SOD2、CAT、GSH-Px的mRNA的表達(dá)水平明顯降低，表明線粒體呼吸作用產(chǎn)生的ROS不能被及時清除，導(dǎo)致相關(guān)區(qū)域的氧化應(yīng)激異常，進(jìn)而使得細(xì)胞凋亡增加，從而導(dǎo)致小鼠下頜切牙變短，發(fā)育異常。

本研究結(jié)果表明，PTHrP核定位序列和C-末端的缺失導(dǎo)致幼年小鼠下頜切牙頸環(huán)細(xì)胞凋亡增加、牙本質(zhì)的胞外基質(zhì)生成和礦化減少，導(dǎo)致了小鼠下頜切牙的發(fā)育異常。