生物發(fā)酵過(guò)程中在線液體分析的整體解決方案

文/ 蘭思杰

本文作者系Endress+Hauser分析產(chǎn)品專家。

發(fā)酵工藝的效率高度依賴于過(guò)程條件的準(zhǔn)確性——只有在穩(wěn)定受控的條件下，微生物的繁殖和收獲才能達(dá)到最佳。因而必須安裝一套成熟可靠的系統(tǒng)來(lái)采集生物反應(yīng)器內(nèi)的信息。

在生物發(fā)酵中，生物反應(yīng)器的測(cè)量點(diǎn)繁雜，而且對(duì)衛(wèi)生性和可追溯性有著極高的要求，如圖1所示。在這些信息當(dāng)中，最重要的參數(shù)就是pH、溶解氧和細(xì)胞濃度，這些數(shù)據(jù)必須被精確地控制和記錄。

pH綜合表征了微生物代謝進(jìn)程，是發(fā)酵過(guò)程中十分重要的控制參數(shù)。pH影響生物酶的活性和細(xì)胞膜的通透性，適當(dāng)?shù)膒H會(huì)促進(jìn)微生物的新陳代謝，反之則會(huì)抑制其活性，降低目標(biāo)產(chǎn)物的得率，例如，胃蛋白酶的最適pH為1.5～2.2，胰蛋白酶的最適pH為8.0～9.0，唾液淀粉酶的最適pH為6.8。pH影響培養(yǎng)基成分的存在狀態(tài)和中間代謝物的解離，直接關(guān)系到生物反應(yīng)方向和反應(yīng)副產(chǎn)物。例如，黑曲霉在pH為2～3時(shí)發(fā)酵產(chǎn)生檸檬酸，在pH近中性時(shí)，則產(chǎn)生草酸。微生物發(fā)酵的不同階段有不同的pH值，因此精準(zhǔn)的pH控制直接關(guān)系到生產(chǎn)效率，在發(fā)酵全周期中必須對(duì)pH實(shí)時(shí)監(jiān)控。

圖1典型生物發(fā)酵中生物反應(yīng)器的在線儀表測(cè)量點(diǎn)

發(fā)酵過(guò)程中的基質(zhì)代謝、發(fā)酵產(chǎn)物的形成、菌體自溶都會(huì)引起介質(zhì)的pH發(fā)生變化。在線pH測(cè)量不僅要求測(cè)量精準(zhǔn)快速，同時(shí)要求傳感器及其對(duì)應(yīng)的安裝支架完全滿足衛(wèi)生要求，不引入雜菌和干擾微生物反應(yīng)的物質(zhì)，如單體丙烯酰胺和銀離子等。除此之外，也要求電極在耐受嚴(yán)苛的原位清洗（CIP）和原位消毒（SIP）后，依然能保持測(cè)量的穩(wěn)定性，從而保障整個(gè)發(fā)酵周期中pH的可靠測(cè)量。

Memosens CPS171D：專為生命科學(xué)行業(yè)研發(fā)的pH電極

特制內(nèi)加壓參比凝膠與離子捕捉阱

CPS171D采用特制的參比凝膠，不含單體丙烯酰胺和動(dòng)物來(lái)源型成分，無(wú)細(xì)胞毒性，對(duì)生物活性沒(méi)有干擾，適用于微生物反應(yīng)過(guò)程的監(jiān)控。參比凝膠出廠前實(shí)現(xiàn)7 bar abs內(nèi)加壓，以減緩介質(zhì)成分浸入對(duì)參比系統(tǒng)的干擾。其內(nèi)部具體結(jié)構(gòu)如圖2所示。

參比凝膠不含銀離子，不會(huì)與培養(yǎng)基中的物質(zhì)產(chǎn)生反應(yīng)（例如，Tris與銀離子反應(yīng)后，在電極內(nèi)部形成黑色沉淀堵塞隔膜）。取而代之的是離子捕捉阱，與傳統(tǒng)電極內(nèi)部直接投加離子捕捉劑不同的是，CPS171D將離子捕捉劑以微管型式固定在Ag/AgCl引線的周圍，可以有效地吸附SIP過(guò)程中引線溶解的銀離子，同時(shí)與過(guò)程中的雜質(zhì)離子反應(yīng)，從而保護(hù)引線與測(cè)量電勢(shì)鏈的完整，其內(nèi)部構(gòu)造如圖3所示。

圖2 CPS171D的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖（1.Memosens 感應(yīng)式接頭；2.FKM O型圈，帶止推環(huán)；3.固定部件；4.電極內(nèi)加壓氣泡指示器；5.Ag/AgCl引線，帶離子捕捉阱；6.衛(wèi)生型微孔陶瓷隔膜；7.NTC 30K溫度傳感；8.Ag/AgCl內(nèi)部參比引線；9.N Type耐高溫型玻璃敏感膜。）

圖3 CPS171D內(nèi)部離子捕捉阱的局部構(gòu)造圖

耐受頻繁CIP/SIP的N Type耐高溫型玻璃敏感膜

CPS171D采用特制的N Type耐高溫型玻璃敏感膜，參比系統(tǒng)不易老化黃變和液化，在頻繁的CIP/SIP下?lián)碛蟹浅：玫牧泓c(diǎn)/斜率穩(wěn)定性及使用壽命。從50次標(biāo)準(zhǔn)SIP后電極的零點(diǎn)和斜率變化中就能一 見(jiàn)端倪，如圖4所示，不難發(fā)現(xiàn)，隨著玻璃敏感膜和凝膠的強(qiáng)化，電極耐受SIP的次數(shù)顯著提升。

圖4 CPS171D與傳統(tǒng)衛(wèi)生型玻璃pH電極在SIP后的魯棒性變化

溶解氧是好氧微生物生長(zhǎng)及合成代謝產(chǎn)物所必需的，但這并不意味著溶解氧的濃度越高越好，溶解氧濃度過(guò)高有時(shí)反而會(huì)抑制目標(biāo)產(chǎn)品的形成。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵需氧量主要與產(chǎn)物的合成途徑有關(guān)，例如，谷氨酸發(fā)酵過(guò)程中，如果溶解氧濃度不足，會(huì)抑制谷氨酸的積累，并在厭氧合成路徑下產(chǎn)生乳酸和琥鉑酸。但是，維生素B12的生產(chǎn)過(guò)程中卻需要采用前期厭氧和后期好氧的方法。因此，發(fā)酵過(guò)程溶中溶解氧的控制實(shí)質(zhì)是，控制發(fā)酵的前、中、后段每一個(gè)時(shí)期的溶解氧都能滿足合成路徑中優(yōu)勢(shì)菌種的氧氣需求，控制溶解氧在合適的時(shí)機(jī)補(bǔ)料、補(bǔ)糖，從而實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)變。

因此，在線溶解氧測(cè)量不但對(duì)傳感器的衛(wèi)生型設(shè)計(jì)和測(cè)量原理提出要求，更為顯著的需求是傳感器在反應(yīng)器中必須能夠快速響應(yīng)，并且穩(wěn)定地反應(yīng)發(fā)酵液中的溶解氧濃度，盡可能不受充氣過(guò)程中氣泡和攪拌帶來(lái)的影響。

以典型的好氧發(fā)酵為例。發(fā)酵前期為微生物對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，菌體大量繁殖，菌體濃度不斷上升，耗氧量不斷增加，溶解氧濃度明顯下降。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，菌體耗氧量有所減少，溶解氧濃度維持平穩(wěn)或小幅上升后，開(kāi)始形成產(chǎn)物。發(fā)酵中后期，菌體呼吸強(qiáng)度趨于平穩(wěn)，如不補(bǔ)料、補(bǔ)糖或改變供氧量，溶解氧濃度幾乎沒(méi)有變化。如果此時(shí)補(bǔ)充碳源或者糖分，發(fā)酵液對(duì)溶解氧的消耗量會(huì)產(chǎn)生變化，應(yīng)隨補(bǔ)料時(shí)的菌齡、補(bǔ)料的種類和補(bǔ)料量，對(duì)溶解氧的濃度和維持時(shí)間進(jìn)行控制，以達(dá)到新的平衡，不然會(huì)抑制目標(biāo)產(chǎn)物的生成。發(fā)酵后期，隨著菌體衰老呼吸強(qiáng)度減弱和菌體的自溶，溶解氧濃度逐漸小幅升高，直至發(fā)酵結(jié)束。這一發(fā)酵過(guò)程中溶解氧的變化曲線如圖5所示。

圖5典型好氧生物發(fā)酵過(guò)程中溶解氧的變化曲線

圖6熒光淬滅法溶解氧傳感器的測(cè)量原理

表1 不同類型熒光帽的表面特性

Memosens COS81D：專門(mén)為發(fā)酵過(guò)程研發(fā)的熒光法溶解氧傳感器

更快的響應(yīng)速度（t90＜10 s、t98＜20 s）和更高的穩(wěn)定性

熒光淬滅法（測(cè)量原理如圖6所示）相較傳統(tǒng)的電化學(xué)法，不需要長(zhǎng)時(shí)間的極化，沒(méi)有需要頻繁維護(hù)更換的覆膜帽、陰極和電解液。傳感器浸入在介質(zhì)中時(shí)，介質(zhì)和熒光層之間能夠迅速建立氧分壓平衡。傳感器光學(xué)部件向熒光層發(fā)出橙色光脈沖信號(hào)，記號(hào)體激發(fā)深紅色熒光。響應(yīng)信號(hào)的衰減時(shí)間和強(qiáng)度與氧濃度和氧分壓直接相關(guān)。內(nèi)置參比LED光源，對(duì)測(cè)量LED光源老化進(jìn)行補(bǔ)償，保證整個(gè)生產(chǎn)批次的測(cè)量值均可靠。

獨(dú)特的C-shape防氣泡聚集型熒光帽

COS81D的熒光帽包含熒光層、光學(xué)隔離層和保護(hù)層以及載板，氧敏感分子（記號(hào)體）集成在光學(xué)活性層（熒光層）中，針對(duì)不同的應(yīng)用工況有兩種截然不同的種類，分別是防氣泡聚集的C-shape型熒光帽和防磨損的U-shape型熒光帽。如表1所示，C-shape熒光帽通過(guò)將熒光層均勻地涂布在預(yù)拉伸凸起的載板上，從而使氣泡在接觸膜片表面時(shí)順膜片邊緣光滑地脫離熒光帽，減少氣泡對(duì)測(cè)量值產(chǎn)生干擾與波動(dòng)。U-shape熒光帽將熒光層保護(hù)在電極的金屬感體內(nèi)部，防止快速的流體沖擊，尤其是研磨性介質(zhì)對(duì)膜片的沖刷，從而延長(zhǎng)電極壽命。

OUSBT66：細(xì)胞增長(zhǎng)和生物質(zhì)量傳感器

細(xì)胞生長(zhǎng)情況的實(shí)時(shí)監(jiān)控是生物發(fā)酵過(guò)程控制的核心參數(shù)之一，使用在線的光密度計(jì)替代采樣細(xì)胞計(jì)數(shù)器是大勢(shì)所趨。在發(fā)酵和結(jié)晶應(yīng)用中的衛(wèi)生型近紅外光譜（NIR）吸收傳感器OUSBT66監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)、生物質(zhì)量、藻類系統(tǒng)和結(jié)晶過(guò)程，可以實(shí)時(shí)提供可靠、精準(zhǔn)的測(cè)量值，優(yōu)化監(jiān)測(cè)過(guò)程和提高產(chǎn)品率。

OUSBT66的內(nèi)部構(gòu)造如7所示，其測(cè)量原理基于經(jīng)典的朗博比爾定律，即吸光度和吸光物質(zhì)濃度之間為線性關(guān)系。光源向介質(zhì)方向發(fā)射光線，光線穿過(guò)介質(zhì)，介質(zhì)另一端的檢測(cè)器測(cè)量穿透介質(zhì)的光線。光電二極管檢測(cè)光線強(qiáng)度，并將其轉(zhuǎn)換成光電流。隨后，變送器將光電流轉(zhuǎn)換成吸光度（AU）或者光密度（OD）。

圖7細(xì)胞增長(zhǎng)和生物質(zhì)量傳感器的測(cè)量原理及構(gòu)造示意圖

圖8在線傳感器和實(shí)驗(yàn)室光度計(jì)測(cè)量固氮螺旋菌和根瘤菌的光密度值

A = -log(T) = εc ·OPL

T = I/I0

式中：

A——吸光度；

T——傳輸率；

ε——消光系數(shù)；

c——濃度；

OPL——光程；

I——檢測(cè)器接收光強(qiáng)度；

I0——光源發(fā)射光強(qiáng)度。

在某個(gè)5000 L的通過(guò)發(fā)酵方式進(jìn)行固氮的生物反應(yīng)器中，同時(shí)使用了在線近紅外傳感器和實(shí)驗(yàn)室可見(jiàn)光光度計(jì)測(cè)試了不同階段固氮螺旋菌和根瘤菌的光密度值，如圖8所示，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在線傳感器和實(shí)驗(yàn)室光度計(jì)之間的測(cè)量值誤差非常微小。同時(shí)，在線傳感器可以實(shí)時(shí)不間斷地測(cè)量罐體部的介質(zhì)光密度值，無(wú)需取樣，不會(huì)受到介質(zhì)在采樣、傳遞和等待過(guò)程中的變質(zhì)和污染的風(fēng)險(xiǎn)。

結(jié)語(yǔ)

Endress+Hauser可為業(yè)界提供完整的發(fā)酵過(guò)程在線測(cè)量整體解決方案，幫助簡(jiǎn)化項(xiàng)目、減少后期維護(hù)成本和停機(jī)時(shí)間。以便在設(shè)計(jì)階段即推行早期標(biāo)準(zhǔn)化，降低資本性支出（CapEx）和運(yùn)營(yíng)成本（OpEx），提高生產(chǎn)效率和投資回報(bào)率（ROI）。作為生物技術(shù)領(lǐng)域可靠的合作伙伴，無(wú)論是中試生產(chǎn)還是自動(dòng)化生產(chǎn)過(guò)程，Endress+Hauser都能為客戶減少風(fēng)險(xiǎn)并優(yōu)化績(jī)效，穩(wěn)步提升質(zhì)量。