紫丁香花中山奈酚-3-O-蕓香糖苷的提取工藝優(yōu)化及含量動(dòng)態(tài)變化規(guī)律

盧潔 王線中 李曉琳康文藝崔麗麗*

1.河南大學(xué)國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心，河南開封 475004;2.開封市保健食品功效成分研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南開封 475004;3.駐馬店市旭升農(nóng)業(yè)科技有限公司，河南駐馬店463800

紫丁香(Syringa oblataLindl.) 為木樨科(Oleace)丁香屬(Syringa)落葉灌木或小喬木，又稱華北紫丁香、百結(jié)等，紫丁香群體花期時(shí)間為20 d，各株間花期在10～17 d 之間，平均花期為14 d[1-2]。

目前，對(duì)紫丁香化學(xué)成分研究主要集中在國(guó)內(nèi)。張樹軍[3-7]課題組系統(tǒng)地研究了紫丁香的化學(xué)成分，對(duì)紫丁香樹枝、樹皮、樹葉、花蕾、種子以及果殼的化學(xué)成分進(jìn)行了詳細(xì)的研究。共分離得到50 余個(gè)化合物，主要是三萜類、苯乙醇類、環(huán)烯醚萜類和苯丙素類化合物。田雷等[8]從紫丁香葉中分離得到(+)松脂素-4″-O-β-D-葡萄吡喃糖苷等9 個(gè)化合物。周業(yè)明[9]從紫丁香葉中分離鑒定得到呋喃甲酸等11個(gè)化合物。李全等[10]從紫丁香葉中分離鑒定得到7-羥基-6-甲氧基香豆素(莨菪亭) 和芹菜素等8 個(gè)化合物。Zhao 等[11]對(duì)紫丁香葉化學(xué)成分進(jìn)行研究，從中分離得到2 個(gè)新的單萜化合物:syringopicrogenin D 和syringopicrogenin E。綜上所述，紫丁香非揮發(fā)性成分主要為環(huán)烯醚萜類、苯乙醇類、苯丙素類和三萜類化合物，黃酮類、有機(jī)酸類等其他成分報(bào)道的較少。

本課題組[12]前期對(duì)河南產(chǎn)紫丁香花化學(xué)成分進(jìn)行研究，分離鑒定了15 個(gè)化合物。其中黃酮類化合物有5 個(gè)，含量較高的化合物有山奈酚-3-O 蕓香糖苷、對(duì)羥基苯乙醇、蘆丁、白蘚苷A、熊果酸等。目前關(guān)于紫丁香花的次生代謝產(chǎn)物含量和動(dòng)態(tài)變化研究較少。紫丁香葉的次生代謝產(chǎn)物含量測(cè)定和動(dòng)態(tài)變化研究較多，主要涉及紫丁香苷、丁香苦苷、羥基酪醇、蘆丁、原兒茶酸、原兒茶醛和酪醇[13-19]，研究表明，紫丁香葉中丁香苦苷含量較高。本研究以紫丁香花中含量較高的山奈酚-3-O 蕓香糖苷(KR)為目標(biāo)成分，采用超聲-高相液相色譜技術(shù)(HPLC)，并結(jié)合單因素篩選、正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)等方法，確定KR最優(yōu)提取條件。研究不同采摘時(shí)間紫丁香花中KR的含量變化，希望對(duì)紫丁香花中KR 的開發(fā)利用提供參考。

1 材料、試劑與儀器

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀(LC-20AT 液相色譜輸液泵、CTO-10AS 柱溫箱、SPD-20A 紫外檢測(cè)器、LC-Solution 色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，日本島津);KQ-500DB 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，江蘇);TGL-16 型高速離心機(jī)(江蘇金壇市中大儀器廠);AB135-S 型十萬(wàn)級(jí)電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，瑞士);分樣篩(上虞市五四儀器篩具廠，浙江);甲醇(HPLC 級(jí)，隴西科學(xué)股份有限公司);甲酸(天津市富宇精細(xì)化工有限公司);純凈水(杭州娃哈哈百利食品有限公司);山奈酚-3-O-蕓香糖苷(批號(hào)JOT-10763，成都普菲德生物技術(shù)有限公司)。

1.2 植物來(lái)源

紫丁香花于2019 年3 月19 日至4 月5 日采集于河南大學(xué)金明校區(qū)，由國(guó)家食用菌專業(yè)加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心李昌勤教授鑒定為木樨科丁香屬植物紫丁香(S.oblata)的干燥花，標(biāo)本存放于河南大學(xué)國(guó)家食用菌專業(yè)加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心。

2 方法

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取KR 適量，精密稱定，加甲醇溶解，制得濃度分別為0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、1.6 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取紫丁香花樣品粉末10 mg，加入適量的提取溶液，超聲提取后離心10 min，吸取上層清液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 色譜條件和系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

按照色譜條件，分別進(jìn)樣對(duì)照品溶液和供試品溶液。如圖1 所示，在此色譜條件下，供試品溶液中KR 的色譜峰與對(duì)照品出峰時(shí)間一致，化合物分離度良好。

色譜柱:LiChrospher?100 RP-18 endcapped(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇(A)-0.25% 甲酸水溶液(B);梯度洗脫:0～46 min，5%～42%A，95%～58%B，46～75 min，42%～60%A，58%～40%B;流速:0.8 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;進(jìn)樣量:10 μL。

2.4 含量測(cè)定

取18 個(gè)不同采集時(shí)間的紫丁香花供試品溶液，按2.3 項(xiàng)下色譜條件依次注入HPLC 分析，按外標(biāo)法計(jì)算KR 的含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 線性關(guān)系考察

精密吸取不同濃度的對(duì)照品溶液，按2.3 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣質(zhì)量(X，μg)為橫坐標(biāo)，得回歸方程Y=1 000 000X-217 372。結(jié)果表明，KR 進(jìn)樣量分別在0.25～32 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.2 提取工藝優(yōu)化-單因素試驗(yàn)

3.2.1 粉碎目數(shù)的選擇

分別考察粉碎目數(shù)為10、30、50、70 目對(duì)KR 提取率的影響。當(dāng)粉碎目數(shù)為50 目時(shí)，對(duì)KR 的提取率達(dá)到最大。因粉碎目數(shù)越大提取率越低，故選擇50 目的分樣篩，見圖2。

圖1 紫丁香花供試品（A）與對(duì)照品（B）的HPLC 圖

圖2 粉碎目數(shù)對(duì)紫丁香花中KR 提取率的影響

3.2.2 超聲時(shí)間的選擇

分別選擇20、30、40、50、60 min 為超聲時(shí)間，按照上述試驗(yàn)條件，比較不同超聲時(shí)間對(duì)KR 提取率的影響，結(jié)果見圖3。當(dāng)超聲時(shí)間為50 min 時(shí)，對(duì)KR 的提取率達(dá)到最大。之后隨著時(shí)間的增加，KR的提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。推測(cè)原因可能是由于超聲過(guò)熱導(dǎo)致部分有效成分分解[20]。因此，最佳提取時(shí)間確定為50 min。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)紫丁香花中KR 提取率的影響

3.2.3 離心轉(zhuǎn)速的選擇

在上述優(yōu)化的最佳條件下，選擇1 000、4 000、7 000、10 000 r/min 考察離心轉(zhuǎn)速對(duì)KR 提取率的影響，結(jié)果見圖4。提取率在4 000 r/min 時(shí)達(dá)到最大，故試驗(yàn)選擇4 000 r/min 作為正交因素水平的中心點(diǎn)。

圖4 離心轉(zhuǎn)速對(duì)紫丁香花中KR 提取率的影響

3.2.4 固液比的選擇

考察固液比為1 ∶100、1 ∶120、1 ∶140、1 ∶160、1 ∶180時(shí)紫丁香花中KR 的含量，結(jié)果見圖5。固液比達(dá)到1 ∶160 時(shí)，KR 提取率達(dá)到最大值;繼續(xù)增加固液比例時(shí)，提取率反而有所下降。這是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，溶劑量的增加使紫丁香花內(nèi)有效成分與溶劑接觸概率增加，有效成分溶出概率也相應(yīng)增加，得率不斷提高;當(dāng)固液比值達(dá)到一定數(shù)值后，超聲波的空化作用對(duì)植物細(xì)胞破裂輔助程度有所下降，且有效成分的溶出也接近飽和，造成提取率出現(xiàn)下降[21]。

3.3 提取工藝優(yōu)化-正交試驗(yàn)

通過(guò)SPSS 19.0 設(shè)計(jì)4 因素3 水平正交實(shí)驗(yàn)(如表1 所示，每個(gè)因素的水平范圍都是參照單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果而定)，篩選紫丁香花中KR 的最佳提取條件。并按照表1 和表2 所設(shè)計(jì)條件制備樣品，按2.3 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC 分析，按照外標(biāo)法計(jì)算KR 的含量。

圖5 固液比對(duì)紫丁香花中KR 的影響

表1 正交試驗(yàn)因素和水平表

通過(guò)固液比(倍)、粉碎目數(shù)(目)、離心轉(zhuǎn)速(r/min)和超聲時(shí)間(min)4 因素3 水平的正交試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)各組合對(duì)KR 的含量影響差異性很大。由表2 所示，固液比的影響因素最大，粉碎目數(shù)次之。實(shí)驗(yàn)因素的主次順序的結(jié)果為:固液比＞粉碎目數(shù)＞離心轉(zhuǎn)速＞超聲時(shí)間，最優(yōu)組合為A3B3C2D2，即:固液比為1 ∶180，粉碎目數(shù)為70 目，離心轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，超聲時(shí)間為50 min。

表2 正交設(shè)計(jì)及極差分析

3.4 紫丁香中KR 含量動(dòng)態(tài)變化

以甲醇為萃取劑，在上述最優(yōu)條件下，對(duì)2019年3 月19 日至4 月5 日的18 批紫丁香花樣品中KR 的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見圖6。

圖6 紫丁香花開放程中KR 含量變化

由圖6 可以看出，在紫丁香花開放過(guò)程中，KR的含量在第9 天達(dá)到最高(8.58 mg/g)。之后隨著花的開放，KR 的含量逐漸降低。KR 的含量整體呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。

3.5 方法學(xué)考察

3.5.1 重復(fù)性試驗(yàn)

精確稱量紫丁香花樣品6 份，按上述最優(yōu)條件制備樣品，并按照2.3 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果表明，KR 的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.78%，說(shuō)明本試驗(yàn)方法重復(fù)性好。

3.5.2 精密度試驗(yàn)

吸取對(duì)照品溶液進(jìn)樣，按照2.3 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果表明，KR 的RSD 為0.43%，表明儀器精密度良好，可以準(zhǔn)確反映物質(zhì)的量。

3.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取紫丁香花1 份，按2.2 項(xiàng)下制備樣品，并按照2.3 項(xiàng)下色譜條件分別在0、4、8、12、16、20、24 h 進(jìn)樣。結(jié)果表明，KR 的RSD 為1.89%，說(shuō)明供試液中KR 在24 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.5.4 加樣回收試驗(yàn)

稱取已知KR 含量的紫丁香花樣品6 份，按2.2項(xiàng)下的操作步驟制備供試品溶液，進(jìn)行測(cè)定樣品中所含KR 的含量，再分別加入KR 標(biāo)準(zhǔn)品，按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，KR 的平均加樣回收率分別為99.09%，其RSD 值分別為1.74%。

4 討論

文獻(xiàn)研究[22]表明，KR 具有保肝、抗肝毒性、神經(jīng)保護(hù)、抗氧化、抗衰老等多種藥理活性。本課題組前期研究表明，KR 具有較好的促凝血活性，促凝血活性和云南白藥相當(dāng)[12]。并且KR 在紫丁香花中的含量相對(duì)較高，具有一定的研究?jī)r(jià)值。本研究確定的紫丁香花中KR 的最佳提取工藝和最佳采收時(shí)間可以為紫丁香花中KR 的開發(fā)利用提供一定的參考。

研究結(jié)果表明，以甲醇為提取溶劑，固液比為1 ∶180，粉碎目數(shù)為70 目，超聲時(shí)間為50 min，離心轉(zhuǎn)速為4 000 r/min 時(shí)，紫丁香花中的KR 提取率最高。在紫丁香花開放過(guò)程中，紫丁香花中的KR 含量在3 月27 日(第9 天)達(dá)到最高(8.58 mg/g)，之后逐漸減少。KR 的含量整體呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。因此要想充分利用紫丁香花中的KR，在花開中期采摘比較好。