基于短引物擴增應用的龍牙百合主要病毒鑒定

周楚人 ，郝曉峰 ，劉一涵，陳咸吉 ，肖揚波 ，曾露芝 ，向蒙，劉甫智，李桂陽，汪啟明*，彭國平*

（1湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，長沙 410128；2道地藥用植物規(guī)范化栽培與綜合利用湖南省工程實驗室，湖南長沙 410128；3湖南一線情農業(yè)有限公司，邵陽 422208；4湖南省康潤農業(yè)科技發(fā)展有限公司，懷化 418013）

龍牙百合（Lilium brownie var.virdulum Baker），是我國一種珍貴的稀有和暢銷的特產蔬菜，是湖南長期栽培的百合地方良種，在湖南邵陽有1 800多年的種植歷史，因其鱗片肥大，形似龍牙而得名，是百合中最名貴的品種之一。它鱗莖個體肥厚、抱合緊密、結拜細嫩、顏色鮮艷、品質優(yōu)良、營養(yǎng)豐富，具有安神寧心、補中益氣、養(yǎng)陰潤肺、理脾健胃等功效，有較高的營養(yǎng)價值及藥用價值［1-3］。

龍牙百合多采用無性繁殖，易造成病毒累積，嚴重危害其產量和品質。目前已報道侵染百合的病毒達19種以上，最主要的為百合斑駁病毒（Lily mottle virus，LMoV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和百合無癥病毒（Lily symptomless virus，LSV）［4，5］。這3種病毒通常以其中2或3種同時侵染百合植株，給百合生產造成嚴重影響［6-8］。研究表明，病毒侵染后的表現(xiàn)包括幼葉向下反卷扭曲、系統(tǒng)花葉、壞死斑、花葉出現(xiàn)斑點或花葉卷曲，植株矮化呈從簇狀，甚至無花、植株無主稈等癥狀，造成百合切花或鱗莖品質嚴重下降。而植株一旦感染則終身攜帶，通過蚜蟲或汁液傳播，病毒傳播范圍進一步擴大［9-11］。

為保證龍牙百合質量，栽培無毒種球是防控百合病毒性病害的根本措施，而有效的病毒檢測技術是確保脫毒苗真正無毒的有效措施。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料于2020年6月取自湖南省邵陽市隆回縣三閣司鎮(zhèn)（27.116415°N，110.978235°E）龍牙百合發(fā)病田，以5點法取樣獲得數(shù)株染病龍牙百合。

1.2 儀器與試劑

實驗儀器：實時熒光定量PCR儀ABI7500、超凈工作臺BIOBAS、微量移液器Eppendorf、漩渦混勻儀Kylin-Bell、掌式離心機Kylin-Bell、熱循環(huán)儀ABI Proflex、電泳儀（上海天能科技有限公司）。

實驗試劑：DEPC處理水（R1600）Solarbio、三氯甲烷（10006818，國藥集團化學試劑有限公司）、Gel-Red染 料（#41003）Biotium、RNA Loading Buffer（9168）TaKaRa、Tris-Borate-EDTA Buffer（TBE）10×Powder，pH8.3（T9122）TaKaRa、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（FP205-02）天根、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（K1622）ThermoFisher、RNAsimple Total RNA Kit（DP419）天根。

根據(jù)NCBI Genebank（The National Center for Biotechnology Information，美國國立生物技術信息中心）中登錄的百合CMV、LMoV、LSV病毒基因序列，應用Primerpremier 6.0軟件分別設計3種病毒的特異性引物。LMoV-99、LMoV-101、LSV-70、LSV-169、CMV-110、CMV-70由上海生工生物工程有限公司合成，具體序列見表1。

表1 實驗所用引物序列Table 1 Primer sequences used in experiments

1.3 龍牙百合總RNA的提取

使用Hipure HP Plant RNA MiNi Kit提取植物總RNA小提試劑盒，按說明書提取總RNA。

1.4 RT-PCR法檢測龍牙百合病害種類

利用RT-PCR法進行龍牙百合主要病毒的檢測。采用引物LMoV-99 R/F、LMoV-101 R/F、LSV-70 R/F、LSV-169 R/F、CMV-110 R/F、CMV-70 R/F，從總RNA提取液中分別擴增CMV、LMoV、LSV等病毒，根據(jù)RT-PCR試劑盒操作說明，設定RT-PCR體系為：（1）體系中加入RNA（90～100 ng/uL）11μL、Random lexamer Primer 1μL，混勻離心，PCR儀上65℃反應5 min，立即置于冰上冷卻，離心后放置冰上。（2）體系中加入5×Reaction Buffer 4μL、Ribolock RNase Inhibition 1μL、10 mM dNTP Mix 2μL、ReverlAid M-MuLV RT 1μL，混勻離心。（3）PCR儀中25℃作用5 min，然后42℃作用60 min，70℃作用5 min，終止反應。（4）補加20 μL NF-H2O至40μL，獲得cDNA并做好標記，隨后檢測。（5）在冰上配制如下反應體系：2×Super-Real PreMix Plus 10μL，相應上下游混合引物10 μM，cDNA 2μL、RNase-free H2O 7.4μL，混勻離心。（6）95℃預變性15 min，95℃變性10 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s。45個循壞進行PCR，產物檢測溶解曲線［12，13］。

2 結果

2.1 總RNA提取結果

使用美吉生物科技有限公司提取植物總RNA小提試劑盒從龍牙百合鱗莖組織提取總RNA，用分光光度儀檢測8份龍牙百合引物總RNA提取液的濃度和純度，檢測結果如表2。其A260/A280值基本在2.0左右，表明純度高，可以進行下一步實驗。

表2 百合提取RNA的純度與濃度Table 2 The purity and concentration of RNA extractedfrom Lily

2.2 病毒檢測結果

圖1 各引物RT-qPCR擴增曲線Fig.1 RT-qPCR amplification curve of each primer

采用引物LMoV-99 R/F、LMoV-101 R/F、LSV-70 R/F、LSV-169 R/F、CMV-110 R/F、CMV-70 R/F從總RNA提取液中分別擴增CMV、LMoV、LSV等病毒。對RT-qPCR產物檢測，其擴增曲線如圖1，溶解曲線如圖2，CT（Cycle threshold）值如表3，凝膠電泳圖如圖3。LMoV99、LMoV101引物的反應產物擴增曲線結果較好，雖然其CT值不穩(wěn)定，但都小于35，LMoV-99引物的反應產物溶解曲線Tm值集中在85.5℃左右，且均為單一峰，而LMoV-99引物的反應產物溶解曲線Tm值集中在84.5℃左右。部分實驗組存在多峰現(xiàn)象，可能出現(xiàn)了非特異性擴增。LSV-70、LSV-169、CMV-110、CMV-70引物的反應產物擴增曲線雖然CT值大部分小于35，但其溶解曲線Tm值小于80℃，且樣本間差異極大，可能是引物間發(fā)生了非特異性擴增。

圖2 各引物RT-qPCR溶解曲線Fig.2 RT-qPCR Melting curve of each primer

凝膠電泳結果顯示，LMoV-99、LMoV-101引物擴增PCR產物的片段長度在100 bp左右，符合預期設計所能擴增出的片段長度，而LSV-169、CMV-70引物擴增PCR產物的片段長度在50 bp以下，不符合預期片段長度，而LSV-70基本沒有獲得PCR產物。

表3 百合病毒cDNA的qPCR循環(huán)閾值Table 3 qPCR cycle threshold table of lily virus cDNA

續(xù)表3

圖3 龍牙百合各引物PCR結果Fig.3 PCR results of different primers of Lilium longicornis

3 討論

在采用RT-PCR檢測百合病毒的文獻報道中，大多數(shù)通過RT-PCR產物中有無病毒的特異片段來判斷被檢測的百合是否感染該病毒［14-16］。筆者在對隆回龍牙百合3種主要病毒CMV、LMoV、LSV的檢測過程中，以95℃預變性15 min，95℃變性10 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，45個循壞的PCR參數(shù)進行RT-qPCR，但只有采用LMoV-99 R/F、LMoV-101 R/F引物進行qPCR時，溶解曲線、擴增曲線符合預期，CT值在15～25之間，之后進行的普通PCR進行凝膠電泳的結果也表明擴增出了LMoV病毒的片段，而以LSV-70 R/F、LSV-169 R/F、CMV-110 R/F、CMV-70 R/F引物進行PCR擴增時，溶解曲線紊亂，擴增曲線顯示CT值普遍在35左右，可以認為是引物二聚體，并沒有擴增出CMV病毒和LSV病毒的特異片段。

4 結論

根據(jù)以上實驗結果，可以判斷隆回縣龍牙百合感染了百合斑駁病毒，而未感染百合無癥病毒及黃瓜花葉病毒。此外，謝晚彬等［17］對江西萬載的龍牙百合進行主要病毒檢測，發(fā)現(xiàn)萬載龍牙百合感染了百合斑駁病毒，沒有感染黃瓜花葉病毒和百合無癥病毒，與本實驗結果一致。筆者認為可能病毒本就存在于龍牙百合種球內，隨后在田間傳播；也有可能龍牙百合對黃瓜花葉病毒和百合無癥病毒有較高的抵抗力，而對百合斑駁病毒抵抗力較弱，易感百合斑駁病。