大鯢血液中免疫球蛋白免疫活性研究

董夢堯， 陳德經(jīng),2*， 賀屹潮， 曾允灝， 胡雙宏

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000；2.陜西理工大學 陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中723000)

大鯢(Andriasdavidianus)屬兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科，是世界現(xiàn)有兩棲類古老動物中壽命最長、體型最長的動物，有“活化石”的美譽，至今已有3億多年演化史[1]。大鯢渾身是寶，黃世英等[2]發(fā)現(xiàn)大鯢肉中蛋白質(zhì)含量高，人體必需的氨基酸、鮮味氨基酸含量豐富，營養(yǎng)價值高。大鯢黏液中富含糖蛋白、膠原蛋白等多種蛋白質(zhì)，抗氧化、抗腫瘤性好，可制作疤痕貼；大鯢骨粉中富含鈣及硫酸軟骨素，用于治療關(guān)節(jié)炎以及骨質(zhì)疏松的藥品開發(fā)有很好的前景。動物血液中富含紅細胞、血小板、血紅蛋白等，是體液免疫的重要組成部分，制成食品可以補充人體所需的多種微量元素及鐵質(zhì)。而目前在宰殺大鯢時，其血液直接流失未加以利用，是一種嚴重的資源損失。

免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)為一類具有抗體活性(或化學結(jié)構(gòu))與抗體相似的球蛋白，是構(gòu)成體液免疫作用的主要物質(zhì)，可增強機體的防御能力。有關(guān)動物血液中免疫球蛋白的研究逐漸廣泛。胡曉艷[3]以新鮮豬血漿為原料，利用飽和硫酸銨鹽析法提取免疫球蛋白得到IgG含量可達88.08%，且IgG無毒并在一定劑量時可不同程度增強小白鼠體液免疫能力；莊甜甜[4]通過新型混合模式吸附層的方法對豬血中免疫球蛋白進行分離純化，得到免疫球蛋白純度達71.4%以上；李廷軍[5]和劉愛國[6]等采用飽和硫酸銨鹽析法和低溫乙醇法，對牦牛血清中免疫球蛋白進行分離提取，得到最優(yōu)工藝條件；于海燕等[7]進一步研究了牦牛血清中免疫球蛋白熱穩(wěn)定性及熱變性動力學；胡剛[8]確定了酶解免疫球蛋白的最佳工藝脫色參數(shù)，得出免疫球蛋白對仔豬體重有明顯增加的影響；銀雪[9]對牛乳中的免疫球蛋白作了提取檢測；游敬剛等[10]綜述了豬血中血漿蛋白的生理活性及制備方法；張效榮等[11]對豬血免疫球蛋白提取條件進行了優(yōu)化，得出pH呈中性，加硫酸銨鹽析提取免疫球蛋白純度最高。魚類血液中也富含多種免疫球蛋白(Ig)，大多為IgM，軟骨魚類中有少見的IgNAR、IgNARC和IgX等[12-13]。林娟娟等[14]應用親和層析技術(shù)對歐洲鰻免疫球蛋白作純化，兔抗血清對得到的Ig有抗原特異性。許娜娜等[15]采用硫酸銨分級沉淀法提取的花鱸Ig為具有79 kDa重鏈和29 kDa輕鏈的免疫球蛋白。對于大鯢血液的研究僅有王芳[16]對患虹彩病毒病大鯢和健康大鯢的血液生理生化指標進行了比較分析，并以大鯢虹彩病毒細胞培養(yǎng)滅活疫苗為免疫原，做免疫大鯢攻毒試驗。而對大鯢血液中免疫球蛋白的研究卻未見相關(guān)報道。

動物血液中免疫球蛋白的研究層面越來越廣，魚類、哺乳動物類均有涉及，大鯢作為兩棲類動物，血液開發(fā)有極好的前景和意義。目前為了保護大鯢血液資源，加大對大鯢血液的開發(fā)利用力度，在宰殺大鯢時收集其新鮮血液，測定血液的常規(guī)指標，并對加入抗凝劑后得到的血清進行脫色脫腥處理，為后續(xù)制備蛋白粉作技術(shù)支撐，同時參照張效榮等[11]對豬血液中免疫球蛋白的提取方法——硫酸胺鹽析、透析袋純化提取免疫球蛋白，采用SDS-PAGE方法測定其蛋白分子量，通過小鼠灌胃實驗，對比實驗組與空白組、環(huán)磷酰胺組的體重差異、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)差異，判斷巨噬細胞功能及免疫因子活性作用，探討免疫球蛋白的免疫活性，為大鯢血的高值化加工與利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗材料：大鯢新鮮血液由陜西省資源生物重點實驗室大鯢養(yǎng)殖室提供(所選3只大鯢均為5～6年生，生長狀態(tài)良好，無疾病，體重3.8～4.0 kg，體長70～80 cm)；SPF級昆明種小鼠購自西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心。

主要試劑：環(huán)磷酰胺購自眾化(杭州)科技有限公司，氯化鈉(分析純)、活性炭、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、30%過氧化氫(分析純)、均購自天津市盛奧化學試劑有限公司，免疫因子檢測試劑盒(IL-6、IFN-γ、TNF-α)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1750型紫外可見分光光度計，日本島津儀器公司；DYCZ-24DN垂直電泳儀，北京六一生物科技有限公司；LGJ-40E型真空冷凍干燥機，北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；酶標儀，江蘇普昀生物技術(shù)有限公司；SYSMEXSF-3000全自動五分類血球計數(shù)儀，日本東亞公司。

1.3 方法

1.3.1 大鯢血液常規(guī)檢驗

采集宰殺空腹1天的大鯢新鮮血液，取2 mL注入EDTA-K2抗凝管，立刻將采血管緩慢地顛倒混勻10次，以防凝固，待15 min后進行測定。使用血球計數(shù)儀檢測血液，觀察并記錄WBC白細胞、RBC紅細胞、血紅蛋白、血小板、尿酸及血糖等各項指標[17-18]。

1.3.2 大鯢血清液的制備

宰殺大鯢時收集大鯢血液，按大鯢血液質(zhì)量與抗凝劑體積的比值為0.5%加入抗凝劑，與大鯢血液混合，攪拌，充分溶解。將血液置于4000 r/min下離心10 min，取上層血清，儲藏于4 ℃冰箱備用[11]。

1.3.3 免疫球蛋白提取工藝

參照文獻[11]對豬血中免疫球蛋白提取方式，確定最佳硫酸銨飽和度，提取工藝如下：

血清溶液→1∶1溶于pH 7 PBS溶液→45%硫酸銨飽和→40 ℃靜置→

高速離心→透析→真空干燥→免疫球蛋白粉末

免疫球蛋白提取率計算公式為

W=m/V，

式中W為提取率(mg/mL)，m為提取得到免疫球蛋白質(zhì)量(mg)，V為提取前血清液體積(mL)。

1.3.4 分子量的測定

取新鮮大鯢血清液、凍干后免疫球蛋白，按1∶1加入上樣緩沖液，按照聚丙烯酰胺凝膠電泳進行檢測，與標品marker進行對照，即得免疫球蛋白的分子量范圍。

1.3.5 動物免疫實驗

環(huán)磷酰胺具有降低免疫力的作用，進入人體內(nèi)被肝臟或腫瘤內(nèi)存在的過量的磷酰胺酶或磷酸酶水解，在醫(yī)療上常用作細胞毒性藥物。免疫毒理學研究時，常將環(huán)磷酰胺作為細胞免疫、體液免疫和巨噬細胞測定時的對照物[19]。

取6～8周齡雄鼠，按體重隨機分為3組，每組8只，體重每周稱量一次，在平均體重達27 g時進行實驗。

正常對照組：每只小鼠灌胃1 mL的0.9%生理鹽水。

環(huán)磷酰胺組：實驗開始前5 d連續(xù)對小鼠每天灌胃80 mg/kg bw(20 mg/mL)1 mL的環(huán)磷酰胺，第6天開始同體積每天灌胃生理鹽水至最終。

免疫球蛋白：實驗開始前5 d連續(xù)對每天灌胃80 mg/kg bw(20 mg/mL)1 mL的環(huán)磷酰胺，第6天開始按250 mg/kg bw(2.5 mg/mL)每天灌胃同體積免疫球蛋白(以生理鹽水溶解)至最終。

1.3.5.1 小鼠免疫臟器指數(shù)測定

胸腺與脾臟為動物免疫機能的主要承載者，分別測定其重量，能夠顯著反映出免疫機能的變換。當胸腺和脾臟發(fā)生細微的形態(tài)變化時，其相對重量改變可作為形態(tài)學指標的一項敏感參數(shù)。將體重達30 g并且灌胃30 d天的小鼠，于停藥次日稱重處死，再取胸腺和脾臟稱重，按下式計算臟器指數(shù)：

式中W1為胸腺指數(shù)(mg/g)，m1為胸腺質(zhì)量(mg)，m0為小鼠質(zhì)量(g)，W2為脾臟指數(shù)(mg/g)，m2為脾臟質(zhì)量(mg)。

1.3.5.2 小鼠腹腔巨噬細胞功能影響

在所有實驗小鼠結(jié)束給予受試物后，給每一只小鼠的腹腔注射體積分數(shù)1%的雞紅細胞(CRBC)0.5 mL。在注射CRBC后1～12 h內(nèi)，采用頸椎脫臼法處死小鼠，并對小鼠腹腔注射生理鹽水2 mL，輕揉腹部10 min后，剪開腹腔皮膚，用注射器吸取腹腔液少許，涂片，于室溫下晾干后用與腹腔液體積比1∶1的丙酮甲醛混合液固定，晾干后采用吉姆薩(Giemsa)染色，30 min后使用蒸餾水漂洗吹干。于油鏡下觀察小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞現(xiàn)象[19-22]。在油鏡下隨機計數(shù)100個巨噬細胞中可吞噬CRBC的巨噬細胞個數(shù)，為吞噬率；被吞噬的CRBC細胞總數(shù)占總共計數(shù)的巨噬細胞的數(shù)量，即吞噬指數(shù)[19]，按下式計算：

式中W3為吞噬率(%)，n1為100個巨噬細胞中吞噬CRBC的細胞個數(shù)，n2為被吞噬的雞紅細胞總數(shù)，n3為計數(shù)的巨噬細胞數(shù)。

1.3.5.3 免疫因子測定

將采集的實驗小鼠血漿嚴格按照小鼠白細胞介素6(IL-6)、γ干擾素(IFN-γ)、α(TNF-α)試劑盒的說明書進行詳細檢測。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 25軟件進行數(shù)據(jù)顯著性分析，數(shù)據(jù)為3次重復所得，基礎(chǔ)數(shù)據(jù)采用M±SD表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鯢血液常規(guī)檢測結(jié)果

目前未見對大鯢同屬類動物血液研究的相關(guān)報道，因此根據(jù)現(xiàn)有研究現(xiàn)狀，將大鯢血液的血液常規(guī)檢測值與正常人、烏雞[23]、牛蛙[24]、烏龜[25]的相關(guān)指標作簡單比較，結(jié)果見表1。

表1結(jié)果說明，大鯢血液中白細胞數(shù)高于人體，低于烏雞，與烏龜血液中的含量相接近，表明其吞噬病菌的能力優(yōu)于人體次于烏雞，與烏龜相當。其紅細胞數(shù)少于烏龜、烏雞，血紅蛋白含量與牛蛙、烏龜?shù)慕咏砻鲀蓷悇游锖难趿康?。大鯢的尿酸值大約只有烏龜與烏雞的1/3，大鯢血、烏雞的血糖偏高，烏龜?shù)难瞧汀?/p>

2.2 大鯢血免疫球蛋白提取率

從大鯢血清液中提取的免疫球蛋白經(jīng)真空冷凍干燥成白色粉末，免疫球蛋白的提取率(占全血的比例)為5.8 mg/mL，比牦牛血清、豬血清的提取率低(牦牛血清為9.205 mg/mL，豬血清為11.5 mg/mL)[4-5]，比鵝血清提取率高(鵝血清為0.681 mg/mL)[26]。

2.3 大鯢血免疫球蛋白分子量

分別對大鯢血清、免疫球蛋白作SDS-PAGE凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示。

1.大鯢血清；2.大鯢血液中提取的免疫球蛋白

由圖1可知，大鯢血清中蛋白種類很多，濃度大，范圍約為22～245 kDa，經(jīng)過硫酸銨提取、透析后得到的免疫球蛋白，在65 kDa、70 kDa周圍有兩條重鏈，40 kDa有一條輕鏈，總分子量約為175 kDa，位于Ig A與IgD之間。鵝血中純化后的免疫球蛋白有兩條泳帶，分別為57 kDa、25 kDa，與IgG的H鏈、L鏈的分子量(55 kDa、24 kDa)相吻合，確定為IgG[26]，豬血中免疫球蛋白分子量為50 kDa、25 kDa[8]，大鯢血由于屬于兩棲動物，其免疫球蛋白重鏈與鵝血、豬血重鏈相差小，輕鏈與魚類相接近。

2.4 免疫作用結(jié)果

2.4.1 免疫球蛋白對小鼠體重的影響

實驗動物在經(jīng)灌胃后，具有明顯毒性的藥物會破壞小鼠的免疫系統(tǒng)，影響導致小鼠體重顯著降低。因此，本實驗對空白組、免疫球蛋白組、環(huán)磷酰胺組的體重變化趨勢作了統(tǒng)計分析，如表2所示。

表2 免疫球蛋白組對小鼠體重的影響

由表2中的數(shù)據(jù)可知，與環(huán)磷酰胺對照組相比，免疫球蛋白組的小鼠各階段體重增加有顯著性差異(P<0.05)，且實驗過程中，免疫球蛋白組在灌胃階段無小鼠死亡，不具有顯著毒性，同時體重比較說明在被機體吸收后對機體的生理性無法通過體重反映。免疫球蛋白對小鼠的體重沒有影響。

2.4.2 小鼠免疫臟器指數(shù)

脾臟是動物的外周免疫器官，能夠顯著地反映機體細胞免疫與體液免疫的免疫效果。灌胃小鼠后檢測脾臟指數(shù)結(jié)果如表3所示。

表3 免疫球蛋白對免疫低下小鼠臟器指數(shù)的影響

由表3的數(shù)據(jù)分析可以得出，與空白組相比，環(huán)磷酰胺組小鼠的胸腺和脾臟明顯萎縮變小，其次占據(jù)小鼠體重比例也與正常小鼠差異顯著(P<0.05)。而免疫球蛋白組的小鼠脾臟指數(shù)與空白組比較，差異不顯著，與環(huán)磷酰胺組比較，差異極其顯著(P<0.01)，胸腺指數(shù)與環(huán)磷酰胺組、空白組比較，均顯著(P<0.05，P<0.01)，則免疫球蛋白對免疫低下的小鼠有減緩環(huán)磷酰胺對小鼠臟器傷害的效果。

2.4.3 小鼠腹腔巨噬細胞功能

巨噬細胞屬于免疫細胞的一種，可參與非特異性防衛(wèi)(先天性免疫)和特異性免疫(細胞免疫)，是細胞免疫學的重要研究對象。本實驗中對免疫低下小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬活性見表4。

表4 免疫球蛋白對免疫低下小鼠的腹腔巨噬細胞功能影響

環(huán)磷酰胺組的小鼠相對于空白組，吞噬能力顯著降低(P<0.05)，而免疫球蛋白組的小鼠，對比空白組，吞噬能力有所降低，但是相比較環(huán)磷酰胺組，吞噬指數(shù)沒有顯著變化(P>0.05)，吞噬率有所增加(P<0.05)，免疫球蛋白對小鼠的吞噬細胞能力不具明顯的影響。

2.4.4 免疫因子測定結(jié)果

TNF-α、IL-6和IFN-γ在血清中含量的變化，是評價給試物對小鼠免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用的重要指標。

由表5可得，對照環(huán)磷酰胺組與空白組發(fā)現(xiàn)，IL-6免疫因子的含量明顯降低(P<0.05)，IFN-γ、TNF-α相對有所降低，但差異不顯著。免疫蛋白組對照空白組、環(huán)磷酰胺組，免疫因子IL-6有所增加，且IL-6的含量與環(huán)磷酰胺組比較，亦增加顯著(P<0.05)。由此可知，免疫球蛋白對于小鼠血清中細胞因子IL-6有明顯的促生作用。

表5 免疫球蛋白對免疫低下小鼠分泌IL-6、IFN-γ、TNF-α能力的影響

3 結(jié)論

大鯢血液中不僅白細胞、血紅蛋白含量與牛蛙和烏龜?shù)南嘟咏?，與烏雞血清生化指標有明顯差異，而且具有豐富的免疫球蛋白，總蛋白分子量約為175 kDa。65 kDa、70 kDa周圍有兩條重鏈，40 kDa有一條輕鏈，與豬血、魚類血液蛋白分子量存在差異。大鯢血液中的免疫球蛋白對實驗小鼠免疫活性(免疫因子IL-6)提高具有顯著作用。

后續(xù)研究對大鯢血液免疫球蛋白提取工藝進行優(yōu)化，可制成蛋白粉類制劑，為大鯢血液保健品的研發(fā)提供基礎(chǔ)，為大鯢血副產(chǎn)物的高值化利用開辟新途徑。